Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse
Summary
Descriviamo una serie di metodi per iniettare coloranti, vettori di DNA, virus e cellule per monitorare sia destino cellulare e fenotipo di cellule endogene e innestate derivate da cellule embrionali o pluripotenti entro embrioni di topo al giorno embrionale (E) 9.5 e fasi successive di sviluppo.
Abstract
Testare il destino di cellule staminali derivati embrionali o pluripotenti nei protocolli in vitro ha portato a risultati controversi che non riflettono necessariamente la loro potenziale vivo. Preferibilmente, queste cellule devono essere collocati in un ambiente embrionale adeguato al fine di acquisire il loro fenotipo definito. Inoltre, linea cellulare tracciando studi nel topo dopo etichettatura cellule con coloranti o vettori retrovirali è rimasto per lo più limitato alle fasi iniziali embrioni di topo con gli organi ancora poco sviluppati. Per superare queste limitazioni, abbiamo progettato i protocolli microiniezione standard e ultrasuoni-mediata per iniettare vari agenti in regioni mirate di cuore in embrioni di topo a E9.5 e fasi successive di sviluppo. Espianto embrionale o gli embrioni vengono poi coltivate o da sinistra a sviluppare ulteriormente in utero. Questi farmaci comprendono coloranti fluorescenti, virus, shRNAs, o cellule staminali progenitrici di cellule di derivazione. I nostri metodi permettono la conservazione del function dell'organo durante il monitoraggio della migrazione e il destino delle cellule marcate e / o iniettati. Queste tecnologie possono essere estesi ad altri organi e sarà molto utile per affrontare le questioni biologiche fondamentali in biologia dello sviluppo.
Introduction
Più di un decennio fa, le cellule staminali embrionali umane (HuESCs) sono state derivate da blastocisti umane 1. Da allora, queste cellule sono diventati oggetto di un importante campo di ricerca che affronta le domande insoddisfatte in biologia dello sviluppo umano. HuESCs hanno inoltre fornito speranze nella medicina rigenerativa. Negli ultimi anni, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) sono stati generati da cellule somatiche paziente-specifiche, fornendo modelli di malattia genetica 2. Molti protocolli in vitro per la differenziazione delle cellule staminali embrionali pluripotenti indotte o verso varie linee cellulari, comprese le linee del cuore 3, sono stati segnalati. Le cellule differenziate sono spesso caratterizzati fenotipicamente mediante analisi di RNA e proteina espressione, immunostaining, e / o nei test funzionali in vitro. Tuttavia, i derivati di cellule staminali pluripotenti devono essere collocati in un ambiente embrionale adeguato per verificare se essi acquisiscono pienamente il cell destino della loro controparte embrionale e se ricapitolano la vera funzione in vivo in risposta alle indicazioni regionali. Mentre l'ingegneria dei tessuti è promettente, ma non fornisce ancora tutti i segnali noti e sconosciuti di una corretta in vivo di sviluppo tessuto embrionale 4,5.
Etichettatura delle cellule con coloranti o vettori retrovirali in embrioni, compresi embrioni di topo, hanno portato importanti informazioni circa l'origine embrionale delle linee cellulari durante lo sviluppo cardiaco 6. Ad esempio, tingere iniezione nello spazio pericardico di embrioni di topo ex vivo, seguita da coltura in vitro di cuori isolati, è stato utilizzato per marcare cellule epicardici ed i loro discendenti 7. Tuttavia, tintura e l'etichettatura delle cellule retrovirali sono stati per lo più applicate agli embrioni precoci di topo con gli organi ancora poco sviluppate, o embrioni di pollo, che sono più facilmente accessibili 8. Un'eccezione è il cervello, che è più facile bersaglio in embryos 9,10. Tale approccio non è stato ancora applicato al battere del cuore embrionale del mouse.
Per completare l'etichettatura diretta con coloranti o virus e di effettuare lineage tracing in embrioni di topo fase più avanzata e topi adulti, l'approccio di etichettatura delle cellule è stato combinato con l'analisi di topi transgenici che utilizzano la tecnologia Cre / Lox. L'approccio Cre / Lox 11 presenta tuttavia alcune limitazioni dovute alla specificità spazio-temporale delle regioni regolatorie genomiche utilizzate per guidare l'espressione della ricombinasi, e l'efficienza della ricombinazione Cre / Lox 12. Inoltre, questo approccio non risolve appieno le domande specifiche della cella migrazione guidata acquisizione del destino delle cellule in quanto si può etichettare solo un precursore dopo l'attivazione della regione regolatoria utilizzato per guidare l'espressione Cre. Inoltre, non può applicarsi agli embrioni umani per ovvie questioni etiche.
Date queste limitazioni, abbiamo progettato una serie di nuovi protocols per iniettare una varietà di agenti di etichettatura cella come coloranti fluorescenti, virus, modulatori dell'espressione genica come shRNAs e vettori etichettatura cella basate sul DNA, o cellule nell'embrione mouse sul E9.5 e stadi di sviluppo in regioni oggetto della cuore.
Le iniezioni di DNA / cellulari utilizzano uno stereomicroscopio e un semplice dispositivo di microiniezione combinato con ex vivo coltura degli embrioni fino a 48 ore, o di cuore isolato o di cultura espianto embrionale per 48-72 ore. Segnaliamo anche un protocollo microiniezione ecografia-mediata in topo cuori embrionali in utero. Questa tecnica permette di monitorare lo sviluppo degli embrioni 13 e consente a lungo termine di follow-up dei injectates e / o cellule marcate.
Abbiamo trovato che questi approcci conservazione della funzione dell'organo e forniscono un ambiente più rappresentativo di test in vitro di cellule staminali potenziale. Esso prevede inoltre la possibilità di seguire la migrazionedi etichettatura e / o iniettato cellule per monitorare il loro destino. In definitiva, questo dovrebbe garantire una migliore comprensione di patterning tessuto regionale e processi biologici chiave.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli intra-cardiaca ex vivo di iniezione sopra descritti sono stati concepiti per preservare la funzione miocardica per almeno 48 ore in mid-stage (E9.5-E11.5) embrioni di topo. Questi approcci iniezione consentire l'iniezione spazialmente mirato di DNA o cellule. I pochi esempi riportati nelle figure 1-3 forniscono la prova di concetto per delineare ex vivo e in vivo dei meccanismi molecolari dei processi di sviluppo che si svolgono in regioni ristrette cardiaci, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono la Fondazione Leducq (valvola mitrale) e l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR concedere Specistem) per il finanziamento di questa ricerca.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Altro | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Riferimenti
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