マウス胎児心臓の開発に細胞標識と注入
Summary
我々は、（E）9.5およびそれ以降の段階の胚日でのマウス胚内に胚または多能性細胞に由来する内因性および移植細胞の細胞運命および表現型の両方を監視するために、染料を注入するためにDNAベクター、ウイルス、および細胞を一連の方法を記載開発。
Abstract
試験管内のプロトコルでの胚性または多能性幹細胞誘導体の運命をテストすることは、必ずしもそれらのインビボの可能性を反映していない論争の成果につながっている。好ましくは、これらの細胞は、それらの明確な表現型を獲得するために適切な胚性環境に置かれるべきである。さらに、染料またはレトロウイルスベクターで細胞を標識した後、マウスでの研究をトレースする細胞系譜はまだよく開発された臓器を、初期段階のマウス胚の大部分が制限されたままである。これらの制限を克服するために、我々は、E9.5および開発の後期段階でのマウス胚の心臓の標的領域に様々な薬剤を注入するために、標準的な超音波媒介性マイクロインジェクションプロトコールを設計した。胚性外植片または胚培養したり、さらに子宮内で開発することが残されている。これらの薬剤は、蛍光染料、ウイルス、shRNAは、細胞または由来始原幹細胞を含む。私たちのアプローチは、FUの保存を可能に臓器のnction移行し、標識および/または注入された細胞の運命を監視しながら。これらの技術は、他の臓器に拡張することができ、開発の生物学の重要な生物学的な質問への回答が非常に参考になります。
Introduction
10年以上前に、ヒト胚性幹細胞（HuESCs）は、ヒト胚盤胞1に由来している。それ以来、これらの細胞は、ヒト発生生物学において未だ満たされていない質問に対処する重要な研究分野の対象となっている。 HuESCsはさらに再生医療に希望を提供してきた。近年、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）が遺伝病2のモデルを提供し、患者特有の体細胞から生成されている。心臓系統3を含む種々の細胞系列に向かって胚または誘導多能性幹細胞の分化のためのインビトロプロトコルにおける多くが、報告されている。分化した細胞は、しばしば免疫染色、および/ またはインビトロ機能試験において 、RNAおよびタンパク質発現の表現型解析によってれる。しかし、多能性幹細胞誘導体は、それらが完全にセルを獲得するかどうかを試験するために適切な胚性環境に置かれなければならLの彼らの胚相手の運命と、彼らは、地域の合図に応答した、本物の生体内機能を再現するかどうか。組織工学は有望であるが、それはまだ胚組織4,5の開発、生体内での適切なすべての既知および未知の手がかりを提供していません。
マウス胚を含む胚中の染料またはレトロウイルスベクターを用いた細胞標識は、心臓の開発6時の細胞系譜の胚起源に関して重要な情報を持ってきた。例えば、単離された心臓のin vitro培養したex vivoでのマウス胚の心膜腔への注射色素は、心外膜細胞およびその子孫7を標識するために使用した。しかし、染料およびレトロウイルス細胞標識は、ほとんどが8より簡単にアクセスできますまだよく開発された臓器、またはニワトリ胚とマウス初期胚に適用されている。例外はEでターゲットしやすい脳、あるmbryos 9,10。このようなアプローチはまだ破っ胚性マウスの心臓に適用されていない。
染料またはウイルスに直接標識を補完するために、より進行した段階のマウス胚および成体マウスにおけるトレース系統を実行するために、細胞標識法は、Cre /ロックス技術を用いて、トランスジェニックマウスの分析と組み合わされている。のCre /ロックスアプローチ11しかしリコンビナーゼの発現を駆動するために使用するゲノム調節領域の時空間特異性、およびのCre / lox組換え12の効率のためにいくつかの制限を提供しています。それだけでCre発現を駆動するために使用される調節領域の活性化後に前駆体を標識することができるように、さらに、このアプローチは、完全に細胞運命の細胞移動駆動の取得の具体的な質問に対処していない。また、明らかに倫理的な問題のために、人間の胚に適用することはできません。
これらの制限を考えると、我々は新しい一連のpを設計しの標的領域にこのような蛍光色素、ウイルス、そのようなshRNAは、およびDNAベースの細胞標識ベクターとしての遺伝子発現モジュレーター、またはE9.5および開発の後期段階におけるマウス胚における細胞のような細胞標識種々の薬剤を注入するrotocols心。
DNA /細胞注入は、実体顕微鏡および48時間、または48〜72時間のために孤立した心臓や胚移植片培養までのex vivoでの胚の培養と組み合わせたシンプルなマイクロインジェクション装置を用いる。我々はまた、 子宮内マウス胎児心超音波媒介マイクロインジェクションプロトコルを報告している。この方法は胚13の開発を監視することができますし、注入物および/ または標識された細胞の長期的なフォローアップが可能になります。
我々は、これらのアプローチは、臓器の機能を保存し、幹細胞の潜在的なin vitro試験よりも代表的な環境を提供することを見出した。また、移動を追跡する機会を提供標識および/またはそれらの運命をモニターするための細胞の注射。最終的に、これは、地域、組織パターニングおよびキー生物学的プロセスのより良い理解を得るべきである。
Protocol
Representative Results
Discussion
上述の心臓内エクスビボ注入プロトコルは、中間段（E9.5〜E11.5）のマウス胚において少なくとも48時間心筋機能を維持するように設計されている。これらの注入のアプローチは、DNAや細胞の空間的に目標と注入を可能にします。 図1〜図3に示すいくつかの例は、ex vivoで 、そのような心内膜または心外膜細胞のEMTとして制限された心臓の地域で行われる発生過程の…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、財団Leducq（僧）と通信社国立がこの研究に資金を提供するためにLAルシェルシュ（ANR Specistemを付与）を注ぐ認める。
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Altro | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Riferimenti
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