Cell Merking og injeksjon i Utvikling Embryonale Mouse Hearts
Summary
Vi beskriver en rekke metoder for å injisere fargestoffer, DNA-vektorer, virus og celler for å overvåke både celle skjebne og fenotype av endogene og podet celler avledet fra embryoniske eller pluripotente celler i mus embryo ved embryonisk dag (E) 9,5 og senere stadier av utviklingen.
Abstract
Testing skjebnen til embryonale eller pluripotent stamcelle-derivater i in vitro-protokoller har ført til kontroversielle utfall som ikke nødvendigvis gjenspeiler deres in vivo potensial. Fortrinnsvis bør disse cellene plasseres i et riktig embryoniske miljø for å erverve sitt bestemt fenotype. Videre har celle avstamning tracing studier i mus etter merking celler med fargestoffer eller retrovirale vektorer forble stort sett begrenset til tidlig stadium mus embryoer med fortsatt dårlig utviklede organer. For å overvinne disse begrensningene, designet vi standard og ultralyd-mediert mikroinjeksjon protokoller for å injisere ulike agenter i målrettede områder av hjertet i muse embryoer ved E9.5 og senere stadier av utviklingen. Embryonale eksplantering eller embryo er så kultivert eller venstre for å videreutvikle i utero. Disse agentene inkluderer fluorescerende fargestoffer, virus, shRNAs eller stamcelle-avledet stamceller. Våre tilnærminger tillate for bevaring av fufunksjons-av organet mens overvåking migrasjon og skjebnen av merkede og / eller injiserte celler. Disse teknologiene kan bli utvidet til andre organer, og vil være svært nyttig for å håndtere viktige biologiske spørsmål i biologi av utviklingen.
Introduction
Mer enn et tiår siden, har menneskelige embryonale stamceller (HuESCs) er avledet fra menneskelige blastocysts en. Siden da har disse cellene bli gjenstand for et viktig forskningsfelt som omhandler udekkede spørsmål i menneskets utviklingsbiologi. HuESCs har dessuten gitt håp i regenerativ medisin. I de senere årene har menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) blitt generert fra pasient-spesifikke somatiske celler, og gir modeller av genetisk sykdom to. Mange in vitro protokoller for differensiering av embryonale eller indusert pluripotent stamceller mot ulike celleslektsnavn, inkludert hjerte linjene 3, har blitt rapportert. De differensierte celler er ofte phenotyped ved analyse av RNA og protein ekspresjon, farging og / eller in vitro-funksjonstester. Men pluripotent stamcelle derivater må plasseres i en skikkelig embryonale miljø for å teste om de fullt ut overta cell skjebnen til sin embryonale motstykke og om de rekapitulere den ekte in vivo funksjon som svar på regionale signaler. Mens tissue engineering er lovende, betyr det ikke likevel gi alle de kjente og ukjente signaler i riktig in vivo utviklings embryonale vev 4,5.
Celle merking med fargestoffer eller retrovirale vektorer i embryoer, inkludert mus embryoer, har brakt viktig informasjon som til embryonale opprinnelse celle linjene under hjerte-utvikling seks. For eksempel, fargestoff injeksjon i det perikardiale plass av museembryoer ex vivo, etterfulgt av in vitro dyrking av isolerte hjerter, ble brukt til å merke epikardiale celler og deres etterkommere 7. Men, har vært mest brukt fargestoff og retroviral celle merking til tidlig mus embryoer med fortsatt dårlig utviklede organer, eller kylling embryo, som er lettere tilgjengelig åtte. Et unntak er hjernen, noe som er lettere å målrette i embryos 9,10. En slik tilnærming har ennå ikke blitt brukt til å slå embryonale mus hjerte.
For å komplettere direkte merking med fargestoffer eller virus og å utføre avstamning tracing i mer avanserte scene mus embryoer og voksne mus, har cellen etikettmetoden blitt kombinert med analyse av transgene mus ved hjelp av Cre / Lox teknologi. Den Cre / LOX tilnærming 11 har imidlertid noen begrensninger på grunn av tid og rom spesifisiteten av de genomiske regulatoriske områder som brukes for å drive ekspresjon av rekombinase, og effektiviteten av Cre / Lox rekombinasjon 12.. Videre gjør denne tilnærmingen ikke fullt ut ta opp konkrete spørsmål av celle migrasjon-drevet oppkjøp av cellen skjebne som det kan bare merke en forløper etter aktivering av det regulatoriske område brukes til å drive Cre uttrykk. Det kan heller ikke gjelde for menneskelige embryoer for åpenbare etiske problemstillinger.
Gitt disse begrensningene, utviklet vi en rekke nye protocols å injisere en rekke cellemarkørmidler slik som fluorescerende fargestoffer, virus, genekspresjon modulatorer slik som shRNAs og DNA-baserte cellemerking vektorer eller celler i mus embryo ved E9.5 og senere stadier av utviklingen i målrettede regioner av hjerte.
De DNA / celleinjeksjoner bruke et stereomikroskop, og en enkel mikroinjeksjon enhet kombinert med ex vivo embryo kultur opptil 48 timer, eller i isolert hjerte eller embryonale eksplantering kultur i 48-72 timer. Vi rapporterer også en ultralyd-mediert mikroinjeksjon protokollen i mus embryonale hjerter i utero. Denne teknikken gjør det mulig å overvåke utviklingen av embryo 13 og gir mulighet for langsiktig oppfølging av injectates og / eller merkede celler.
Vi har funnet at disse tilnærmingene bevare funksjonen av organet og gi et mer representativt miljø enn in vitro testing av stamcelle potensial. Det gir også mulighet til å følge migrasjonav merket og / eller injisert celler for å overvåke deres skjebne. Til syvende og sist, bør dette gi en bedre forståelse av regional vev mønster og viktige biologiske prosesser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den intra-kardiale ex vivo injeksjon protokollen beskrevet ovenfor er utformet for å bevare hjerteinfarkt funksjon i minst 48 timer i midten av scenen (E9.5-E11.5) mus embryoer. Disse injeksjons tilnærminger tillate romlig målrettet injeksjon av DNA eller celler. De få eksemplene som er vist i figur 1-3 gir proof of concept for opptegning ex vivo og in vivo molekylære mekanismer av utviklingsprosesser som finner sted i bundne hjerte regioner, slik som EMT av endokardiale …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkjenner stiftelsen Leducq (mitral) og Agence Nationale pour la Recherche (gi ANR Specistem) for å finansiere denne forskningen.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Altro | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
