Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato
Summary
Nós descrevemos uma série de métodos para injectar corantes, os vectores de ADN, vírus e células, a fim de controlar tanto o destino celular e fenótipo das células endógenas e enxertados derivados de células embrionárias ou pluripotentes dentro de embriões de ratinho no dia embrionário (E) 9,5 e as fases posteriores de desenvolvimento.
Abstract
Testando o destino de células-tronco embrionárias de derivativos ou pluripotentes in vitro protocolos levou a resultados controversos que não necessariamente refletem seu potencial in vivo. De preferência, essas células devem ser colocados num ambiente embrionária adequada, a fim de adquirir o seu fenótipo definitiva. Além disso, células de linhagem rastreamento estudos no rato após marcação das células com corantes ou vetores retrovirais permanece mais limitada a embriões de camundongos em fase inicial com órgãos ainda pouco desenvolvidos. Para superar essas limitações, nós projetamos protocolos microinjeção padrão e mediada por ultra-som para injetar vários agentes em regiões-alvo do coração em embriões de camundongos em E9.5 e estágios mais avançados de desenvolvimento. Explante embrionárias ou embriões são então cultivados ou à esquerda para continuar a desenvolver no útero. Esses agentes incluem corantes fluorescentes, vírus, shRNAs, ou células-tronco progenitoras derivadas de células. Nossos abordagens permitir preservação do function do órgão durante o acompanhamento de migração e destino de células marcadas e / ou injetadas. Estas tecnologias podem ser estendidos a outros órgãos e será muito útil para abordar questões biológicas fundamentais em biologia do desenvolvimento.
Introduction
Mais de uma década atrás, as células-tronco embrionárias humanas (HuESCs) foram derivadas de blastocistos humanos 1. Desde então, estas células tornaram-se objecto de um importante campo de pesquisa que aborda questões não satisfeitas em biologia do desenvolvimento humano. HuESCs ter ainda fornecido esperanças na medicina regenerativa. Nos últimos anos, as células estaminais pluripotentes humanas induzidas (iPSCs) foram geradas a partir de células somáticas de doentes específica, o fornecimento de modelos de doença genética 2. Muitos em protocolos in vitro para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas ou embrionárias para várias linhagens celulares, incluindo linhagens coração 3, foram relatados. As células diferenciadas são frequentemente fenotipadas por análise de ARN e a expressão da proteína, a imunocoloração, e / ou em testes funcionais in vitro. No entanto, os derivados de células estaminais pluripotentes tem que ser colocada num ambiente embrionária adequada, a fim de testar se adquirem totalmente o cell destino de suas contrapartes embrionárias e se recapitular a função in vivo genuíno em resposta às sugestões regionais. Enquanto a engenharia de tecidos é promissor, ainda não fornecem todos os sinais conhecidos e desconhecidos do bom desenvolvimento in vivo tecido embrionário 4,5.
Rotulagem celular com corantes ou vetores retrovirais em embriões, incluindo embriões de camundongos, trouxeram informações importantes sobre a origem embrionária das linhagens de células durante o desenvolvimento cardíaco 6. Por exemplo, corante de injecção para dentro do espaço pericárdico de embriões de ratinho ex vivo, seguido de cultura in vitro de corações isolados, foi usado para marcar as células do epicárdio e seus descendentes 7. No entanto, corante e marcação celular retroviral foram aplicados principalmente para embriões de rato com os órgãos ainda pouco desenvolvidos, ou embriões de galinha, que são mais facilmente acessível 8. Uma exceção é o cérebro, que é mais fácil de atingir em embryos 9,10. Tal abordagem ainda não tenha sido aplicada ao coração do rato embrionário de bater.
Para complementar a rotulagem direto com corantes ou vírus e para realizar o rastreamento em estágio mais avançado embriões de camundongos e ratos adultos da linhagem, a abordagem marcação celular foi combinada com análise de camundongos transgênicos, utilizando a tecnologia Cre / Lox. A abordagem Cre / Lox 11 apresenta no entanto algumas limitações devido à especificidade espaço-temporal das regiões reguladoras genómicas utilizadas para conduzir a expressão da recombinase, e a eficiência da recombinação Cre / Lox 12. Além disso, esta abordagem não contempla plenamente as questões específicas de aquisição orientada a migração de células de destino da célula, uma vez que só pode rotular um precursor após a ativação da região reguladora usada para dirigir a expressão Cre. Ele também não pode aplicar-se a embriões humanos para as questões éticas óbvias.
Dadas essas limitações, nós projetamos uma série de novos protocols para injectar uma variedade de agentes de marcação de células, tais como corantes fluorescentes, vírus, moduladores de expressão de genes, tais como vectores de rotulagem e shRNAs celular à base de ADN, ou células no embrião de rato em E9.5 e as fases posteriores do desenvolvimento em regiões alvo do coração.
As injeções de DNA / celulares usar uma lupa e um dispositivo de microinjeção simples combinado com ex vivo de cultura de embriões de até 48 horas, ou de coração isolado ou cultura explante embrionário para 48-72 horas. Nós também relatam um protocolo de microinjeção mediada por ultra-som nos corações embrionárias de rato no útero. Esta técnica permite acompanhar o desenvolvimento de embriões 13 e permite a longo prazo de seguimento dos injectates e / ou células marcadas.
Descobrimos que estas abordagens preservar a função do órgão e proporcionar um ambiente mais representativo do que os testes in vitro de potencial de células estaminais. Ele também oferece a oportunidade de acompanhar a migraçãode rotulados e / ou injetaram células para controlar o seu destino. Em última análise, este deve proporcionar uma melhor compreensão da padronização tecido regional e processos biológicos fundamentais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os ex vivo protocolos de injeção intra-cardíacas descritas acima são projetados para preservar a função miocárdica por pelo menos 48 horas, em meados de estágio (E9.5-E11.5) embriões de camundongos. Estas abordagens de injecção de permitir a injecção espacialmente direccionada de DNA ou células. Os poucos exemplos mostrados nas Figuras 1-3 fornecer prova de conceito para delinear ex vivo e em mecanismos moleculares in vivo de processos de desenvolvimento…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem o Leducq Foundation (mitral) ea Agence Nationale pour la Recherche (ANR conceder Specistem) para o financiamento desta pesquisa.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Altro | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
