Маркировка сотовый и впрыска в развивающихся эмбриональных сердце мыши
Summary
Мы описываем ряд методов, чтобы ввести красители, векторы ДНК, вирусы, и клетки с целью мониторинга как судьбу клеток и фенотип эндогенных и трансплантированных клеток, полученных из эмбриональных или плюрипотентных клеток в эмбрионы мышей в эмбриональный день (E) 9.5 и более поздних этапах развития.
Abstract
Тестирование судьбу эмбриональных или плюрипотентных стволовых клеток-производных в протоколах в пробирке привело к спорным результатам, которые не обязательно отражают их в естественных условиях потенциал. Предпочтительно, эти клетки должны быть размещены в надлежащем эмбриональной среды, чтобы приобрести их определенный фенотип. Кроме того, сотовый линия трассировки исследования в мыши после мечения клеток с красителями или ретровирусных векторов осталась в основном ограничивается ранних мышиных эмбрионов сцене с еще слабо развитой органов. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали стандартные и ультразвуковые опосредованного протоколы микроинъекции для нагнетания различных агентов в целевых регионах сердца у эмбрионов мышей на E9.5 и поздних стадиях развития. Эмбриональные эксплант или эмбрионы затем культивировали или влево для дальнейшего развития в утробе матери. Эти средства включают флуоресцентные красители, вирусы, shRNAs или стволовые клетки-предшественники клеток, полученных. Наши подходы позволяют сохранения фуnction органа при мониторинге миграции и судьбу меченых и / или вводили клетки. Эти технологии могут быть распространены на другие органы и будет очень полезно для решения ключевых биологические вопросы в биологии развития.
Introduction
Более десяти лет назад, человеческие эмбриональные стволовые клетки (HuESCs) были получены из человеческих бластоцист 1. С тех пор, эти клетки стали предметом одной из важных областей исследований в котором рассматриваются неудовлетворенные вопросы в биологии человека развития. HuESCs бы, кроме того, при условии, надежды в регенеративной медицине. В последние годы человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) были получены от конкретного пациента соматических клеток, обеспечивая моделей генетических заболеваний 2. Многие в протоколах пробирке для дифференцировки эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к различным клеточных линий, в том числе сердца линий 3, не поступало. Дифференцированные клетки часто phenotyped путем анализа РНК и экспрессии белка, иммунным окрашиванием, и / или в пробирке функциональных тестов. Тем не менее, плюрипотентные производные стволовых клеток должен быть установлен в соответствующем эмбриональной среды, чтобы проверить полностью ли они приобретают CELл судьба их эмбрионального коллегой и резюмировать ли они подлинную естественных условиях функцию в в ответ на региональные подсказки. В то время как тканевая инженерия является перспективным, то это еще не обеспечивают все известные и неизвестные сигналы от собственно в естественных условиях развивающимся эмбриональных тканей 4,5.
Сотовый маркировка с красителями или ретровирусных векторов у эмбрионов, в том числе эмбрионов мыши, принесли важную информацию в отношении эмбрионального происхождения клеточных линий во время развития сердца 6. Например, краситель инъекции в перикардиальной пространстве мышиных эмбрионов экс виво, после чего культуры в пробирке изолированных сердцах, был использован для обозначения эпикардиальные клеток и их потомков 7. Тем не менее, краситель и ретровирусная мечения клеток были в основном применяется для ранних мышиных эмбрионов с еще слабо развитой органов или куриных эмбрионах, которые более легко доступны 8. Исключением является мозг, который легче цели в еmbryos 9,10. Такой подход еще не применяется к биению эмбрионального сердца мыши.
В дополнение к прямой маркировки с красителями или вирусом и выполнять происхождение трассировки в более продвинутые мышиные эмбрионы сцене и взрослых мышей, подход мечения клеток была в сочетании с анализом трансгенных мышей с использованием технологии Cre / Lox. Подход Cre / Жидкий кислород 11, однако имеет некоторые ограничения, связанные с пространственно-временной специфики геномных регуляторных областей, используемых для управления экспрессией рекомбиназы и эффективности Cre / Lox рекомбинации 12. Кроме того, этот подход не полностью учитывать конкретные вопросы миграции клеток приводом приобретения судьбы клеток, как это может только знак предшественника после активации регуляторной области, используемой для управления экспрессией Cre. Он также не может применяться к человеческих эмбрионов по понятным этическим вопросам.
Учитывая эти ограничения, мы разработали ряд новых рrotocols вводить разнообразные маркировки клеток агентов, таких как флуоресцентные красители, вирусов, экспрессии генов модуляторов, таких как shRNAs и на основе ДНК маркировки клеток векторами, или клеток в эмбрионе мыши на E9.5 и поздних стадиях развития в целевых регионах сердце.
DNA / сотовые инъекции использовать стереомикроскопа и простой микроинъекции устройство в сочетании с экс естественных культуры эмбриона до 48 часов, или изолированного сердца или эмбрионального эксплантата культуры в течение 48-72 часов. Мы также сообщаем протокол микроинъекции ультразвуковое опосредованного в мышиных эмбриональных сердца в период внутриутробного развития. Эта методика позволяет следить за развитием эмбрионов 13 и позволяет для долгосрочного наблюдения из injectates и / или меченых клеток.
Мы обнаружили, что эти подходы сохранить функцию органа и обеспечить более представительный среды, чем испытания в пробирке потенциала стволовых клеток. Он также предоставляет возможность следить миграциимеченых и / или вводят клетки для контроля за их судьбу. В конечном счете, это должно дать более глубокое понимание регионального паттерна тканей и основных биологических процессов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Бывшие естественных условиях протоколы внутри сердца инъекции, описанные выше, предназначены для сохранения функции миокарда, по крайней мере 48 часов в середине стадии (E9.5-E11.5) эмбрионов мыши. Эти подходы позволяют инъекций пространственно целевой инъекции ДНК или клеток. Несколь…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают, Фонд Leducq (МИТРАЛЬНОГО) и Национальное агентство по Pour La Recherche (грант ANR Specistem) за финансирование работы.
Materials
| Setups / Hardware | |||
| 40 MHz Transducer | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjector | VisualSonics | ||
| Microinjector | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulator | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogen | required to pressurize the injector | ||
| Rail system | VisualSonics | ||
| rotator | to rotate glass tube with embryos inside the incubator | ||
| Standard incubator | 5% CO2, 37 C | ||
| stereomicroscope | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| borosilicate capillary tubes | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2 mm external diameter |
| pipette puller | Sutter | Model P87 | |
| microinjection needles | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip |
| Hamilton syringes | |||
| Petridishes | 10 cm diameter | ||
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Silicon membrane | Visualsonics | 4.3×4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurane | Vet One | ||
| hair removal agent | Nair | ||
| eye lubricant | Optixcare | 31779 | |
| Electrode gel (Signa) | Parker | ||
| Suture | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Ultrasound gel | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0.05-0.1 mg/kg in saline |
| Altro | |||
| Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Glass petridishes | Fine Science Tools | 60mm diameter | |
| insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Media and culture reagents | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco’s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | high glucose and 50% rat serum |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| rat serum | Janvier | ODI 7158 | |
| pennicilin/streptomycin | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxygen 40% | Air liquid | required to oxygenate the embryo culture medium | |
| fetal calf serum | Fisher | RVJ35882 | |
| matrigel | BD | 356230 | |
| collagen type I | BD | 354236 | to coat culture dishes for explant culture |
| culture dishes | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injectates | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use. |
| PGK-GFP-expressing lentivirus | ~8E9 transducing units/ml DMEM | ||
| lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Riferimenti
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111, 344-358 (2012).
- Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).
- Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials. Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).
- Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc. Res. In press, (2012).
- Cai, C. L., et al. A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells. Nature. 454, 104-108 (2008).
- Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken. J. Vis. Exp. , (2010).
- Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells. Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J. Vis. Exp. , (2010).
- Nagy, A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26, 99-109 (2000).
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal. Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).
- Phoon, C. K. Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development. Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Dyer, L. A., Patterson, C. A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse. J. Vix. Exp. , (2013).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
