1. Kemi forberedelse Forberedelse og opbevaring af PLL-g-PEG-Biotin og avidin: Polymeren PLL-g-PEG-biotin opløses i PBS-buffer i henhold til producentens anvisninger i en koncentration på 1,0 mg/ml. Aliquot efter dækslets størrelse (se tabel 1)og opbevares ved -80 °C i op til et år. Forberedelse og opbevaring af Avidin/NeutrAvidin Den umærkede Avidin/NeutrAvidin opløses i PBS-buffer i henhold til fabrikantens anvisninger i en koncentration på 1,0 mg/ml. Aliquot efter dækslets størrelse (se tabel 1)og opbevares ved -20 °C i op til 3 år. Virusprøveforberedelse: Forbered virusprøver i henhold til eksperimentelt behov og laboratorieprotokol forud for denne analyse. Brug trin 1.3.1 til metode 5A eller 1.3.2 til metode 5B. Forbered virusprøver til metode 5A forud for fase 2. Der anvendes tilberedte virusprøver senest 1-2 dage efter tilberedningen eller i henhold til dækslets glidestørrelse (se tabel 1),og der føres derefter fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C i op til et år. Når optøet, brug straks. Der fremstilles virusprøver til metode 5B svarende til 1.3.1. Aliquots af virus opødes før 5B og opbevares ved 4 °C højst 24 timer inden blanding med antistoffer. Forbered passende biotinylerede antistoffer til forsøget. 2. Coverlip Rengøring som forberedelse til kemisk behandling Placer coverlips i en passende størrelse Teflon coverslip rack, der holder dem i lodret retning og nedsænke dem i et bægerglas fyldt med filtreret (0,2 μm) ethylalkohol (190 bevis). Sonicate coverlips i den filtrerede ethylalkohol (190 bevis) i 30 min. Fjern coverslips fra alkohol og skyl coverslips omfattende med ultrapure vand. Placer skyllede coverslips i en separat ren Teflon rack og bægerglas fyldt med 1 M NaOH. Sonicate coverlips i 1 M NaOH i 30 min. Fjern coverslips fra NaOH og skyl dem meget med ultrapure vand. Tør de skyllede coverslips med en nitrogenstrøm, og læg dem i et rent, tørt Teflon rack. Undersøg coverlips for synlige film eller partikler, der forbliver på coverlip. Hvis der er synligt materiale tilbage, er coverlip’en ikke blevet ordentligt rengjort og skyllet. Hvis ikke korrekt rengjort gentage trin 2.1-2.7. Rengør coverslips med ilt-plasma i 2 min. Dette trin er valgfrit, men anbefales. 3. Dannelse af PLL-g-PEG tyndfilmslag Umiddelbart efter tørring i nitrogenstrømmen (eller det valgfrie iltplasma) anbringes et coverlip vandret i en steril petriskål. Pipet i midten af dækslet en passende mængde optøet PBS buffered PLL-g-PEG-biotin (se tabel 1). Placer en anden renset coverslip oven på væsken i en sandwich metode. Bemærk, at denne metode består i at have to coverslips inkubere deres kemiske film ved at orientere deres kemisk behandlede “aktive ansigter” mod hinanden, kun adskilt af det nuværende kemiske lag. Sørg for, at der er tilstrækkelig væske til, at lydstyrken mellem de to coverlips er helt fyldt med væske, men at der ikke siver væske ud mellem dækslerne (se tabel 1). Den “aktive ansigt” fremover betegner coverslip ansigter, som har været i kontakt med væsken i sandwich konfiguration. Læg låget af Petri parabol over coverslip sandwich og inkubere på RT i 45-60 min. Fjern låget af Petri parabol og afhente sandwich med et par pincet. Pas på ikke at klemme overskydende væske ud. Brug tommelfingeren og pegefingeren til at klemme sandwichen let og skub coverlips i modsatte retninger vandret i forhold til hinanden, og adskil derefter de to coverlips fra hinanden uden at røre ved de aktive ansigter. Skyl begge aktive ansigter med ultrapure vand ved at pipette 25 ml ultrapure vand over det aktive ansigt 2-4x, og tør derefter coverlips med en nitrogenstrøm. Sørg for at bemærke, hvilke coverslip-flader der er aktive. Udnyt coverlips straks, eller opbevar O / N med den aktive ansigt op i en steril Petri parabol placeret i en støvfri lav luftfugtighed miljø. 4. Avidin bindende forbedring Placer en PLL-g-PEG behandlet coverslip med aktivt ansigt op i en steril petriskål. Pipetter en passende mængde optøet avidin i buffer (tilberedt i trin 1.2) på midten af det aktive ansigt. Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) oven på væsken i sandwich metode. Bemærk den aktive ansigt coverlips. Det er vigtigt, at de aktive ansigter er i kontakt med væsken under inkubationen (se trin 3.2). Læg låget af petriskålen over coverslip sandwich og inkuber på RT i 25-30 min. Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter. Skyl begge aktive ansigter med ultrapure vand ved at pipette 25 ml ultrapure vand over det aktive ansigt 2-4x og tør derefter coverlips med en nitrogenstrøm. Bemærk den aktive ansigt coverlips. Brug straks til næste fase. VIGTIG BEMÆRKNING: Der findes to forskellige metoder til at afslutte prøveforberedelsen afhængigt af den type analyse, som forsøget indebærer. Forsøgsbehandleren skal fortsætte med fase 5A, hvor virusset er forankret i glasset, før der tilsættes yderligere antistofbehandling, der kræves til billeddannelse i superopløsning. 5B beskriver en alternativ metode til mærkning af virus i opløsning, før forankring det til glasset. De repræsentative data i dette manuskript udarbejdes ved hjælp af 5A. Der bør vælges en passende metode efter forsøgsanalysetype. 5A. Aktivt ansigtsantistof tøjr Umiddelbart efter tørring med en nitrogenstrøm i fase 4.6, placere en ivrig behandlet coverslip aktiv med billedsiden op i en steril Petri parabol. Der pipettes en passende mængde optøet biotinyleret antistof i buffer på midten af det aktive ansigt (se tabel 1). Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) oven på væsken i en sandwich metode. Bemærk den aktive ansigt coverlips, er det vigtigt de aktive ansigter er i kontakt med væsken til inkubation (se trin 3.2.). Læg låget af Petri parabol over coverslip sandwich og inkubere på RT i 45-60 min. Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter. Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x, tør ikke og brug det samme. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive. Placer et antistofbehandlet coverlip aktivt med forsiden nedad i en steril petriskål, og pipette en passende mængde optøet virus i buffer på midten af det aktive ansigt. Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) oven på væsken i en sandwich metode. Bemærk det aktive ansigt, da det er vigtigt, at de aktive ansigter er i kontakt med væsken til inkubation (se trin 3.2.). Læg låget af Petri parabol over coverslip sandwich og inkubere på RT i 45-60 min. Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter. Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x. Tør ikke coverlips, i stedet placere dem i en Teflon rack og bægerglas fyldt med PBS straks. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive. De forberedte prøver anvendes straks eller opbevares i en passende buffer ved 4 °C i op til tre dage uden væsentlig mistede integritet.Vigtig bemærkning: Hvis prøverne skal anvendes i en AFM-analyse, er præparatet færdigt, og de kan anvendes med det samme eller opbevares som beskrevet i trin 5A.20 – 5A.21. Hvis prøverne skal anvendes i en fluorescensbilledanalyse i superopløsning, skal du gå videre til den antistofmærkning, der er beskrevet i trin 5A.12 – 5A.19. Placer begge virusbehandlede coverlips aktive med forsiden op i en steril petriskål og pipet nok proteinblokeringsbuffer på coverlips til at perle nok væskevolumen til at dække de centrale 95% af coverlipet uden at flyde nogen blokeringsbuffer fra coverlipet (typisk 100 – 200 μl.) Inkuber på RT i 60-90 min. Fjern forsigtigt blokeringsbufferen ved at fjerne coverslips en ad gangen fra petriskålen og hælde væsken ud af dækslet i et affaldsbæger. Pas på ikke at tabe coverlip. Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x, tør ikke og brug det samme. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive. Placer en enkelt blokerende buffer behandlet coverslip aktiv med billedsiden op i en steril Petri parabol, og pipette en passende mængde fluorescerende mærket viral antistof i buffer på midten af det aktive ansigt. Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) på toppen af væsken i en sandwich metode. Bemærk, hvilket ansigt der er aktivt, det er vigtigt, at de aktive ansigter er i kontakt med væsken til inkubation (se trin 3.2). Læg låget af petriskålen over coverslip sandwich og inkuber på RT i 30 min. Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter. Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x, tør ikke og brug det samme. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive. Tør ikke coverlips, i stedet placere dem i en Teflon rack i et bægerglas fyldt med PBS. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive. De forberedte prøver anvendes straks eller opbevares i en passende buffer ved 4 °C i op til tre dage uden væsentlig mistede integritet. 5B. Angreb mod opløsningsantistof Denne metode er en valgfri forbedring af mærkningsstrategien for fluorescerende billedbehandling i superopløsning. Ved at anvende i opløsning angreb, bedre antistof belægning på den virale overflade kan opnås. Bland antistofopløsninger i forhold efter forsøgsbehov. Eksempel 1:4-forholdet på 0,01 mg/ml biotinyleret antistof til 0,01 mg/ml fluorescerende mærket antistof vil give en god bindende affinitet og give mulighed for god kuvertgenvinding i en billedanalyse med superopløsning. Der blandes lige store portioner af henholdsvis antistof- og virusopløsningerne i (5B.1) og (1.3). Bland forsigtigt ved pipettering op og ned et par gange i aliquot. Denne resulterende opløsning kan opbevares, indtil det er nødvendigt i op til 24 timer ved 4 °C. Når trin 4.6 er afsluttet, skal du placere en ivrig behandlet coverlip med aktivt ansigt op i en steril petriskål. Pipetter en passende mængde virus med antistofopløsning (fremstillet i trin 5B.2) på midten af det aktive ansigt. Placer en anden coverslip (aktiv ansigt nedad) oven på væsken i en sandwich metode. Bemærk det aktive ansigt, da det er vigtigt, at de aktive ansigter er i kontakt med væsken til inkubation (se trin 3.2). Læg låget af Petri parabol over coverslip sandwich og inkubere på RT i 45-60 min. Fjern petriskålens låg og adskil de to coverslips som beskrevet i trin 3.4, og sørg for at holde styr på og ikke røre ved de aktive ansigter. Skyl begge aktive flader med PBS ved at pipetter 25 ml PBS over det aktive ansigt 2-4x. Tør ikke coverlips, i stedet placere dem i en Teflon rack og bægerglas fyldt med PBS straks. Sørg for at holde styr på, hvilke coverslip-flader der er aktive. Der anvendes straks eller opbevares forberedte prøver ved 4 °C i op til tre dage uden væsentlig mistede integritet. 6. Atomic Force Mikroskopi Materiale Ejendom Måling Tænd for AFM-laserne, og åbn AFM-softwaren. Vælg den relevante scanningstilstand for den ønskede analyse i åbningsdialogboksen. Alle nødvendige vinduer skal åbnes som standard. hvis ikke se i brugervejledningen for at åbne de ønskede vinduer. Vælg en cantilever, der passer til den ønskede måling, og indsæt den i udliggerhuset i overensstemmelse med producentens retningslinjer. Der er en bred vifte af betingelser og eksperimenttyper, hvor der er en række cantilevers. Eksperimentatoren bør forske cantilevers efter deres behov. Sæt udligningshuset i AFM-hovedet i overensstemmelse med producentens retningslinjer. Hvis prøven skal anvendes under våde forhold, skal prøven fjernes fra lagerbufferen og fortsættes til trin 6.7. Hvis prøven skal anvendes under omgivende (tørre) forhold, skal prøven tages ud af opbevaringsbufferen og skylles kortvarigt ved at dyppe den i et bægerglas ultrapurt vand. Bemærk: Dette vil efterlade et tyndt hydreringslag på prøven, som kan fremkalde kapillær attraktion med cantilevers med en lav fjederkonstant. Hvis prøven skal anvendes under omgivende (tørre) forhold, skal prøven forsigtigt tørres med en nitrogenstrøm. Tør forsigtigt bagsiden af coverlipet med et støvfrit filterpapir, og sørg for ikke at røre prøvens aktive ansigt. Prøven anbringes i den relevante AFM-prøveholder, og prøven anbringes derefter på AFM-stadiet. Hvis prøven skal afbildes under våde forhold, pipettes en lille mængde buffer på prøveemnets midte (~10 μl). Placer AFM-hovedet over prøven. Hvis prøven er våd, skal du sørge for, at cantilever og AFM spids trænger ind i overfladelaget, og at der ikke er bobler mellem cantilever og cantilever boliger. Juster AFM-laseren med udkragede i overensstemmelse med producentens anbefalinger for at opnå det optimale signal. Mål cantilever resonansfrekvensen, og indstil scanningsfrekvensen efter eksperimenttype. Sænk AFM-spidsen til overfladen, og optimer signalindstillingerne. Udfør en 20 μm firkantet AFM-scanning i den tilstand, du vælger. Trykningstilstand (AC) blev brugt til at generere repræsentative data. Identificer viruskandidater efter omtrentlig højde, som typisk kan ses som skarpe pigge på glasoverfladen. Vælg en viruskandidat, og centrer scanningshovedet over det. Udfør en 250 nm firkantet scanning (eller passende scanning med superopløsning) om den valgte virus for at få dens topologi og retning. Vælg et punkt på virussen til måling af materialeegenskaben(f.eks. midten af en sfærisk virus til en Youngs modulus-måling), og udfør målingen i henhold til producentens anvisninger. 7. Billedbehandlingsmetode i superopløsning Åbn billedbehandlingssoftwaren i superopløsning, og kalibrer softwaren i overensstemmelse med producentens retningslinjer. Kalibrere superopløsningsbilledbehandlingsudstyret i overensstemmelse med producentens anvisninger ved hjælp af lysstofrør. Prøvebilledbufferen samles fra lagrene lige før billeddannelse ved at kombinere 50 μl 1 M MEA og 100 μl 10x Gloxy til 850 μl lagerbuffer. Hold billedbufferen på is under hele forsøget. Fjern en forberedt coverslip med prøve fra opbevaringsbufferen, og skyl den 5x ved at dyppe den i et bægerglas ultrapure vand. Tør den ikke-aktive coverslip ansigt ved hjælp af en støvfri filterpapir. Sørg for ikke at røre det aktive ansigt. Sæt den i en prøveholder til billedbehandlingssystemet, og tilfør prøveholderen 250 μl billedbuffer. Det er rimeligt at udskifte billedbufferen på prøven hver 2. time for at opretholde ensartede resultater. Dæk prøveholderen med parafilm for at mindske atmosfærisk interaktion med rummiljøet. Sæt prøveholderen i billedbehandlingsudstyret til billedbehandling. Bring prøven i fokus ved hjælp af producentens anvisninger. Billede prøven i henhold til super-opløsning teknik, der anvendes. Sørg for at justere billedforholdene for at optimere signalet, samtidig med at samtidige aktiveringer af foto-switchable fluorophores reduceres.VIGTIGT: Billedbehandlingsbetingelserne er prøveafhængige og varierer efter forsøgsbehov. Et typisk eksperiment, der bruger Alexa 647, initialiseres effektivt til deres mørke tilstand i billedbufferen, kan derefter fotoaktiveres ved anvendelse af 405 nm UV-lys. Billeder opnås ved spændende en sparsom delmængde af Alexa 647 molekyler i en tæt mærket prøve og lokalisere hver fluorophore med en præcision, der primært er begrænset af antallet af indsamlede fotoner. Denne procedure gentages gentagne gange af softwaren, indtil et ønsket antal erhvervelsescyklusser er sket. Forsøgsforsøget skal have denne indstilling korreleret med, at hver fluorrør i prøven er blevet fotobleget. Når billedbehandling er afsluttet, skal du lukke billedbehandlingsudstyret i henhold til producentens anvisninger. Softwaren kan være åben for dataanalyse. Dataanalyse er stærkt afhængig af eksperiment; I alle tilfælde identificeres virus imidlertid ved deres fulde bredde ved et halvt maksimum, hvilket sammenlignes med de kendte virusdimensioner, idet der tages hensyn til den ekstra størrelse af fluorescerende etiketter. For bedre visualisering kan du se eksempler ved at bruge enten Isosurface-gengivelsesindstillingen eller den volumetriske gengivelsesindstilling, som begge typisk findes i billedbehandlingssoftware i superopløsning.