1. Voorbereiding van de chemie Bereiding en opslag van PLL-g-PEG-Biotine en avidin: Los het polymeer PLL-g-PEG-biotine op in PBS-buffer volgens de aanwijzingen van de fabrikant bij een concentratie van 1,0 mg/ml. Aliquot volgens de grootte van de afdeklip (zie tabel 1)en bewaren bij -80 °C gedurende maximaal één jaar. Bereiding en opslag van Avidin/NeutrAvidin Los de ongelabelde Avidin/NeutrAvidin op in pbs-buffer volgens de aanwijzingen van de fabrikant bij een concentratie van 1,0 mg/ml. Aliquot volgens de grootte van de afdeklip (zie tabel 1)en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 3 jaar. Voorbereiding van virusmonsters: Bereid virusmonsters voor volgens experimentele behoefte en laboratoriumprotocol voorafgaand aan deze test. Gebruik stap 1.3.1 voor methode 5A of 1.3.2 voor methode 5B. Bereid virusmonsters voor methode 5A voor op fase 2. Gebruik bereide virale monsters binnen 1-2 dagen na bereiding, of aliquot volgens de grootte van de hoesstrook (zie tabel 1)en flash freeze in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C gedurende maximaal één jaar. Bij ontdooiing onmiddellijk gebruiken. Bereid virusmonsters voor methode 5B vergelijkbaar met 1.3.1. Ontdooi aliquots van het virus vóór 5B en bewaar bij 4 °C niet meer dan 24 uur voordat u zich mengt met antilichamen. Bereid geschikte biotinylated antilichamen voor het experiment voor. 2. Coverslip reiniging ter voorbereiding op chemische behandeling Plaats afdeklips in een teflon afdekliprek van de juiste grootte dat ze verticaal houdt en dompel ze onder in een bekerglas gevuld met gefilterde (0,2 μm) ethylalcohol (190 proof). Soniceer de dekenslips in de gefilterde ethylalcohol (190 proof) gedurende 30 minuten. Verwijder de afdeklips van alcohol en spoel de afdeklips uitgebreid af met ultrapure water. Plaats gespoelde afdeklips in een apart schoon Teflon rek en bekerglas gevuld met 1 M NaOH. Soniceer de coverslips in de 1 M NaOH gedurende 30 min. Verwijder de afdeklipjes van NaOH en spoel ze uitgebreid af met ultrapure water. Droog de gespoelde afdeklips met een stikstofstroom en plaats ze in een schoon, droog Teflon-rek. Controleer de afdeklips op zichtbare film of deeltjes die op de afdeklip achterblijven. Als er zichtbaar materiaal overblijft, is de afdeklip niet goed gereinigd en gespoeld. Als de stap 2.1-2.7 niet goed is gereinigd. Reinig de deklipjes gedurende 2 minuten met zuurstof-plasma. Deze stap is optioneel, maar wordt aanbevolen. 3. Vorming van de PLL-g-PEG Thin Film Layer Onmiddellijk na het drogen in de stikstofstroom (of het optionele zuurstofplasma) plaatst u een afdeklip horizontaal in een steriele petrischaal. Pipet in het midden van de afdekkingenlip een passende hoeveelheid ontdooide PBS gebufferde PLL-g-PEG-biotine (zie tabel 1). Plaats een andere gereinigde hoeslip bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Merk op dat deze methode bestaat uit het hebben van twee coverslips die hun chemische films incuberen door hun chemisch behandelde “actieve gezichten” naar elkaar toe te richten, alleen gescheiden door de huidige chemische laag. Zorg ervoor dat er voldoende vloeistof is, zodat het volume tussen de twee afdeklips volledig gevuld is met vloeistof, maar dat er geen vloeistof uit de afdeklips lekt (zie tabel 1). Het “actieve gezicht” duidt voortaan deklipvlakken aan die in contact zijn geweest met de vloeistof in de sandwichconfiguratie. Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje coverlip en incubeer bij RT gedurende 45-60 min. Verwijder het deksel van petrischaaltje en pak de sandwich op met een pincet. Zorg ervoor dat u overtollig vocht niet uitknijpt. Gebruik de duim en wijsvinger om de sandwich lichtjes te knijpen en schuif de afdeklipjes horizontaal in tegengestelde richting ten opzichte van elkaar en scheid vervolgens de twee afdeklips van elkaar zonder de actieve gezichten aan te raken. Spoel beide actieve vlakken af met ultrapure water door 25 ml ultrapure water 2-4x over het actieve gezicht te gieten en droog vervolgens de afdeklips met een stikstofstroom. Zorg ervoor dat u opmerkt welke coverslipvlakken actief zijn. Gebruik de afdeklips onmiddellijk of bewaar O/N met het actieve gezicht naar boven in een steriele petrischaal die in een stofvrije omgeving met een lage luchtvochtigheid is geplaatst. 4. Avidin Binding Verbetering Plaats een met PLL-g-PEG behandelde hoeslip met actief gezicht naar boven in een steriele petrischaal. Pipetteer een geschikte hoeveelheid ontdooide avidin in buffer (voorbereid in stap 1.2) op het midden van het actieve gezicht. Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in de sandwichmethode. Let op het actieve gezicht van de coverslips. Het is belangrijk dat de actieve gezichten tijdens de incubatie in contact komen met de vloeistof (zie stap 3.2). Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje deklip en incubeer bij RT gedurende 25-30 min. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt. Spoel beide actieve vlakken af met ultrapure water door 25 ml ultrapure water 2-4x over het actieve gezicht te gieten en droog vervolgens de afdeklips af met een stikstofstroom. Let op het actieve gezicht van de coverslips. Onmiddellijk gebruiken voor de volgende fase. BELANGRIJKE OPMERKING: Er zijn twee verschillende methoden voor het voltooien van de monstervoorbereiding, afhankelijk van het type test dat het experiment met zich meebrengt. De experimenteerder moet doorgaan met stadium 5A waarin het virus aan het glas is verankerd voordat een aanvullende antilichaambehandeling wordt toegevoegd die nodig is voor beeldvorming met superresolutie. 5B beschrijft een alternatieve methode om het virus in oplossing te labelen voordat het aan het glas wordt verankerd. De representatieve gegevens in dit manuscript worden opgesteld met behulp van 5A. Een geschikte methode moet worden gekozen op basis van het experimentele testtype. 5A. Actieve gezichtsantilichaam tether Onmiddellijk na het drogen met een stikstofstroom in fase 4.6, plaatst u een met avidin behandelde hoezenlip actief met het gezicht naar boven in een steriele petrischaal. Pipetteer een geschikte hoeveelheid ontdooid biotinylated antilichaam in buffer op het midden van het actieve gezicht (zie tabel 1). Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Let op het actieve gezicht van de deklips, het is belangrijk dat de actieve gezichten in contact komen met de vloeistof voor incubatie (zie stap 3.2.). Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje coverlip en incubeer bij RT gedurende 45-60 min. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te gieten, niet drogen en onmiddellijk gebruiken. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn. Plaats een met antilichamen behandelde deklip actief gezicht omhoog in een steriele petrischaal en pipetteer een geschikte hoeveelheid ontdooid virus in de buffer op het midden van het actieve gezicht. Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Let op het actieve gezicht, omdat het belangrijk is dat de actieve gezichten in contact zijn met de vloeistof voor incubatie (zie stap 3.2.). Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje coverlip en incubeer bij RT gedurende 45-60 min. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te pipetten. Droog de afdeklips niet af, maar plaats ze onmiddellijk in een Teflon-rek en beker gevuld met PBS. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn. Gebruik de bereide monsters onmiddellijk of bewaar ze maximaal drie dagen in een geschikte buffer bij 4 °C zonder significant verlies van integriteit.Belangrijke OPMERKING: Als monsters in een AFM-test moeten worden gebruikt, is het preparaat compleet en kunnen ze onmiddellijk worden gebruikt of opgeslagen zoals beschreven in stap 5A.20 – 5A.21. Als monsters moeten worden gebruikt in een fluorescentiebeeldvormingstest met superresolutie, gaat u verder met de antilichaametikettering die wordt beschreven in stap 5A.12 – 5A.19. Plaats beide met virussen behandelde coverslips met het actieve gezicht naar boven in een steriele Petrischaal en pipet voldoende eiwitblokkeerbuffer op de coverslips om voldoende vloeistofvolume te bedekken om de centrale 95% van de coverslip te bedekken zonder een blokkerende buffer van de afdeklip te laten stromen (meestal 100 – 200 μl.) Incubeer bij RT gedurende 60-90 minuten. Verwijder voorzichtig de blokkeerbuffer door de afdeklips één voor één uit de Petrischaal te verwijderen en de vloeistof van de afdeklip in een afvalbeker te gieten. Pas op dat u de afdeklip niet laat vallen. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te gieten, niet drogen en onmiddellijk gebruiken. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn. Plaats een enkele blokkerende buffer behandelde coverslip actief gezicht omhoog in een steriele Petrischaal, en pipetteer een geschikte hoeveelheid fluorescerend gelabeld viraal antilichaam in buffer op het midden van het actieve gezicht. Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Merk op welk gezicht actief is, het is belangrijk dat de actieve gezichten in contact zijn met de vloeistof voor incubatie (zie stap 3.2). Plaats het deksel van de Petrischaal over de deksellip sandwich en incubeer bij RT gedurende 30 minuten. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te gieten, niet drogen en onmiddellijk gebruiken. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn. Droog de afdeklips niet af, maar plaats ze in een Teflon-rek in een bekerglas gevuld met PBS. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn. Gebruik de bereide monsters onmiddellijk of bewaar ze maximaal drie dagen in een geschikte buffer bij 4 °C zonder significant verlies van integriteit. 5B. In oplossing antilichaamaanval Deze methode is een optionele verbetering van de etiketteringsstrategie voor de fluorescentiebeeldvorming met superresolutie. Door de in-oplossingsaanval aan te brengen, kan een betere antilichaamcoating op het virale oppervlak worden bereikt. Meng antilichaamoplossingen in verhoudingen volgens experimenten die nodig zijn. Voorbeeld 1:4 verhouding van 0,01 mg/ml biotinylated antilichaam tot 0,01 mg/ml fluorescerend gelabeld antilichaam geeft een goede bindingsaffiniteit en zorgt voor een goed envelopherstel in een beeldvormingstest met superresolutie. Meng gelijke delen van het antilichaam en de virusoplossingen die respectievelijk zijn bereid in (5B.1) en (1.3). Meng voorzichtig door een paar keer op en neer te gaan in de aliquot. Deze resulterende oplossing kan tot 24 uur bij 4 °C worden bewaard. Na voltooiing van stap 4.6 plaatst u een met avidin behandelde deklip met actief gezicht naar boven in een steriele petrischaal. Pipetteer een geschikte hoeveelheid virus met antilichaamoplossing (bereid in stap 5B.2) op het midden van het actieve gezicht. Plaats een andere afdeklip (actief gezicht naar beneden) bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Let op het actieve gezicht, omdat het belangrijk is dat de actieve gezichten in contact komen met de vloeistof voor incubatie (zie stap 3.2). Plaats het deksel van de Petrischaal over de broodje coverlip en incubeer bij RT gedurende 45-60 min. Verwijder het deksel van de Petrischaal en scheid de twee deksellipjes zoals beschreven in stap 3.4, zorg ervoor dat u de actieve vlakken bijhoudt en niet aanraakt. Spoel beide actieve vlakken af met PBS door 25 ml PBS 2-4x over het actieve gezicht te pipetten. Droog de afdeklips niet af, maar plaats ze onmiddellijk in een Teflon-rek en beker gevuld met PBS. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke coverslip-vlakken actief zijn. Gebruik bereide monsters onmiddellijk of bewaar ze maximaal drie dagen bij 4 °C zonder significant verlies van integriteit. 6. Atomic Force Microscopie Materiaal Eigenschap Meting Schakel de AFM lasers in en open de AFM software. Selecteer de juiste scanmodus voor de gewenste test in het openingsdialoogvenster. Alle benodigde vensters moeten standaard worden geopend; als u de gebruikershandleiding niet raadpleegt om de gewenste vensters te openen. Selecteer een cantilever die geschikt is voor de gewenste meting en plaats deze in de cantileverbehuizing volgens de richtlijnen van de fabrikant. Er zijn een breed scala aan omstandigheden en experimenttypen waarvoor er een verscheidenheid aan cantilevers is. De experimenteerder moet cantilevers onderzoeken op basis van hun behoefte. Plaats de cantileverbehuizing volgens de richtlijnen van de fabrikant in de AFM-kop. Als het monster onder natte omstandigheden moet worden gebruikt, verwijdert u het monster uit de opslagbuffer en gaat u verder met stap 6.7. Als het monster onder omgevings(droge) omstandigheden moet worden gebruikt, verwijdert u het monster uit de opslagbuffer en spoelt u het kort af door het in een bekerglas met ultrapure water te dompelen. Opmerking: Dit laat een dunne hydratatielaag achter op het monster die capillaire aantrekkingskracht kan veroorzaken met cantilevers met een lage veerconstante. Als het monster in omgevingsomstandigheden (droog) moet worden gebruikt, droogt u het monster voorzichtig af met een stikstofstroom. Droog de achterkant van de afdeklip voorzichtig af met een stofvrij filterpapier en zorg ervoor dat u het actieve vlak van het monster niet aanraakt. Plaats het monster in de juiste AFM-monsterhouder en plaats het monster vervolgens op het AFM-podium. Als het monster onder natte omstandigheden moet worden afgebeeld, voert u een kleine hoeveelheid buffer op het midden van het monster (~ 10 μl). Plaats de AFM-kop boven het monster. Als het monster nat is, zorg er dan voor dat de cantilever- en AFM-tip de oppervlaktelaag binnendringen en dat er geen bellen tussen de cantilever- en cantileverbehuizing zitten. Lijn de AFM-laser uit met de cantilever in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant om het optimale signaal te verkrijgen. Meet de cantilever resonantiefrequentie en stel de scanfrequentie in op basis van het experimenttype. Laat de AFM-tip naar de oppervlakte zakken en optimaliseer de signaalinstellingen. Voer een 20 μm vierkante AFM-scan uit in de modus van uw keuze. De tikmodus (AC) werd gebruikt bij het genereren van representatieve gegevens. Identificeer viruskandidaten op geschatte hoogte, die meestal kan worden gezien als scherpe spikes op het glazen oppervlak. Selecteer een viruskandidaat en centreer de scankop erboven. Voer een vierkante scan van 250 nm (of de juiste superresolutiescan) uit over het geselecteerde virus om de topologie en oriëntatie ervan te verkrijgen. Selecteer een punt op het virus voor de materiaaleigenschapsmeting(bijv. het centrum van een bolvormig virus voor de modulusmeting van een Young) en voer de meting uit volgens de aanwijzingen van de fabrikant. 7. Beeldvormingsmethode met superresolutie Open de beeldvormingssoftware met superresolutie en kalibreer de software volgens de richtlijnen van de fabrikant. Kalibreer de beeldvormingsapparatuur met superresolutie in overeenstemming met de aanwijzingen van de fabrikant met behulp van fluorescerende kralen. Stel de monsterbeeldvormingsbuffer samen uit voorraden vlak voor de beeldvorming door 50 μl 1 M MEA en 100 μl 10x Gloxy te combineren met 850 μl voorraadbuffer. Houd de beeldvormingsbuffer op ijs voor de duur van het experiment. Verwijder een voorbereide afdeklip met monster uit de opslagbuffer en spoel deze 5x af door deze in een beker met ultrapure water te dompelen. Droog de niet-actieve hoezenlip met een stofvrij filterpapier. Zorg ervoor dat u het actieve gezicht niet aanraakt. Plaats in een monsterhouder van een beeldvormingssysteem en voeg 250 μl beeldvormingsbuffer toe aan de monsterhouder. Het is redelijk om de beeldvormingsbuffer op het monster om de 2 uur uit te wisselen om consistente resultaten te behouden. Bedek de monsterhouder met parafilm om de atmosferische interactie met de ruimteomgeving te verminderen. Plaats de monsterhouder in de beeldvormingsapparatuur voor beeldvorming. Breng het monster in beeld met behulp van de aanwijzingen van de fabrikant. Beeld het monster volgens de superresolutietechniek die wordt gebruikt. Zorg ervoor dat u de beeldomstandigheden aanpast om het signaal te optimaliseren en tegelijkertijd de activering van fotoschakelbare fluoroforen te verminderen.BELANGRIJKE OPMERKING: Beeldvormingsomstandigheden zijn afhankelijk van het monster en variëren afhankelijk van de experimentele behoefte. Een typisch experiment met Alexa 647 dat efficiënt is geïnitialiseerd naar hun donkere toestand in de beeldvormingsbuffer, kan vervolgens worden geactiveerd door toepassing van 405 nm UV-licht. Afbeeldingen worden verkregen door een schaarse subset van Alexa 647-moleculen in een dicht gelabeld monster te bekijken en elke fluorofoor te lokaliseren met een precisie die voornamelijk wordt beperkt door het aantal verzamelde fotonen. Deze procedure wordt herhaaldelijk door de software geïntensreerd totdat een gewenst aantal acquisitiecycli heeft plaatsgevonden. De experimenteerder moet deze instelling laten correleren met elke fluorofoor in het monster die op de foto is gebleekt. Wanneer de beeldvorming is voltooid, sluit u de beeldvormingsapparatuur af volgens de aanwijzingen van de fabrikant. De software kan open blijven voor gegevensanalyse. Data-analyse is sterk afhankelijk van experiment; identificeer virussen echter in alle gevallen aan de slag met hun volledige breedte op maximaal de helft, wat wordt vergeleken met de bekende virusafmetingen, waarbij rekening wordt gehouden met de extra grootte van fluorescerende etiketten. Voor een betere visualisatie bekijkt u voorbeelden door gebruik te maken van de optie Isosurface rendering of de volumetrische renderingoptie, die beide meestal worden gevonden in imaging-software met superresolutie.