人中性粒细胞流动室粘附实验

Summary

报道定量中性粒细胞粘附的方法。此方法创建类似于血管遇到了动态流环境。它使中性粒细胞粘附到任何纯化黏附分子（配体）或类似体内环境与剪切应力的上下文内皮细胞基板（HUVEC）的调查。

Abstract

嗜中性粒细胞牢固粘附到内皮细胞在炎症在健康和疾病的关键作用。中性粒细胞粘附牢固的过程中涉及到许多不同的粘附分子，包括_β2整合素家族的成员和他们的反受体ICAM家庭。最近，在天然存在的遗传变异体_β2整合素和ICAM的被报道与自身免疫性疾病相关联。因此，中性粒细胞从这些粘附分子的不同等位基因型个体的定量涂胶量是相对于自身免疫相关的发展机制研究的重要。在流动室系统粘附研究，可以创建具有相似于血管环境在体内观察到的流体剪切应力的环境。在这里，我们提出了一个方法，用流室法系统来研究人外周血中性粒细胞的定量粘接性能s到人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和纯化的配体的底物。用这种方法，从供体与粘附受体的不同等位基因变体的中性粒细胞的粘合能力，可以评估和比较。这种方法也可以被修改，以评估其他主要类型的细胞或细胞系的附着。

Introduction

在两个_β2整合素和ICAM在配位体的遗传变异，现在认为与自身免疫性疾病^1,2的发展相关联。在从与这些变体的个体来源的细胞这些变体的功能性后果的确定是必要的我们的这些变体如何有助于自身免疫性疾病的发病机制的理解。这种功能研究允许由自然发生的遗传变异塑造健康和疾病的免疫反应机制的决心。在SLE的具体例子，我们现在知道在ITGAM（细胞CD11b）的变种及其配体，ICAM-1，具有强烈的^1,2疾病发展相关联。因为中性粒细胞是至关重要的炎症反应，中性粒细胞粘附的定量研究可提供机械洞察ITGAM / ICAM遗传变异如何改变炎症。

NeutropHIL牢固粘附于内皮细胞（EC）是一个高度管制的过程中起着炎症反应^3,4至关重要的作用。中性粒细胞的粘附牢固如下初始中性粒细胞滚动和捕获欧共体，并最终可能导致轮回体内 。这些过程涉及许多不同种类的粘附分子，包括ICAM-1，ICAM-2，P-选择素，E-选择素在血管内皮细胞和_β2整合素对嗜中性粒细胞^5-9。因此，从捐助者与粘附分子的不同等位基因变异小心量化中性粒细胞粘附的将是重要的，了解这些遗传变异的功能和病理的后果。

实验使用一个流动室可以建立一种体外环境下用类似于血管体内环境^10-12观察到的流体剪切应力。的确，一个流室法加上人类umbili卡尔静脉内皮细胞（HUVEC）可以模仿血管的体内环境。使用这种方法，可以研究对血管内皮细胞的总细胞的粘合性能。此外，该流动室的高度可控的环境也允许细胞进行评估结合到纯化的密合性配体，例如ICAM-1，以促进特异性受体 – 配体相互作用的研究。

我们在这里提出一个利用一个流室粘附实验系统，研究人末梢血嗜中性粒细胞的粘接性的HUVEC和纯化的配体基片的方法。使用这种方法与捐助者的细胞表达不同的粘附分子等位基因变异体使我们能够评估如何将这些基因变异可以改变人中性粒细胞粘附牢固。

Protocol

招募本研究所有捐助者签署知情同意书和研究经阿拉巴马大学伯明翰分校机构审查委员会。 1，血管内皮细胞初代培养和传代培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC） 在体外在由血管内皮细胞基础培养基中的完全生长培养基（见材料清单），补充有内皮细胞生长因子。 注：在本研究中使用的生长因子包括：5毫微克/毫升的人重组表皮生长因子（hEGF的），1.0毫克/毫升氢化可的松，50毫克/毫升庆大霉素和50毫微克/毫升两性霉素-B（GA-1000），2个％胎牛血清（FBS），0.5纳克/毫升的血管内皮生长因子（VEGF），10纳克/毫升的人类成纤维细胞生长因子基本与肝素（hFGF-B），20纳克/毫升的重组人胰岛素样生长因子（ R 3-IGF-1），1微克/毫升抗坏血酸和22.5微克/毫升肝素。完全培养基制备最初在37℃和然后可被储存在4℃下1个月的制剂中使用。 准备一个烧瓶中的细胞，完全培养基加入到75 厘米的组织培养烧瓶中（1毫升/ 5厘米2），然后将烧瓶使其平衡至37℃/ 5％CO 2的加湿培养箱中培养至少30分钟。人脐静脉内皮细胞将被直接接种到这个平衡的培养烧瓶中，在2,500-5,000细胞/ cm 2的密度。 虽然媒体是平衡，迅速解冻股票脐静脉内皮细胞冻存管在37℃水浴。通过涡旋使细胞分散在原始储存小瓶，然后将它们直接添加到含有预平衡的HUVEC完全生长培养基中以达到2500-5000个细胞/ cm 2的密度培养瓶中。轻轻摇动烧瓶以均匀分布的细胞，然后将烧瓶返回到培养箱中。这些细胞现在代表的第一通道。 <李>中应改为每两天，直到细胞70-80％汇合。 在内皮细胞，现在可以从培养瓶中用胰蛋白酶/ EDTA收获。培养基从培养瓶中后跟的PBS冲洗，以从细胞中除去任何残留的蛋白和钙吸出。 0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液，并在2-6分钟细胞脱离所评估光镜应该是显而易见的。 当90％的细胞被四舍五入掉板中，加入2倍的胰蛋白酶抑制剂的等体积停止胰蛋白酶消化。为了便于细胞的收获，加入完全生长培养基的另一个等量。转移分离的细胞中的无菌15ml离心管中。 离心分离的细胞在225×g离心5分钟，在室温下进行。吸出上清液，然后重悬细胞在2-3完全生长培养基中。测定细胞浓度和存活率用血球计数器和台盼蓝。 利用日Ë收获细胞进行研究，重新播种额外75 厘米瓶与细胞以10,000细胞/ cm 2的密度，并继续执行步骤2.2。或者，细胞可以在此时被冻结为今后的研究。用于细胞冷冻，离心沉淀细胞，在225×g离心5分钟，在室温下进行。吸出上清，重悬细胞沉淀在含胎牛血清10％DMSO中以1×10 6个细胞/ ml的浓度。在细胞悬浮液中的细胞在细胞冷冻集装箱冷冻后，然后转移到冷冻管并储存于-80℃。 2，血管内皮细胞层的制备利用冷冻第二通道脐静脉内皮细胞：复兴与文化。如果使用生长活跃的细胞，进行步骤2.2。 含解冻迅速从1.8步在37℃水浴2 次通过脐静脉内皮细胞的离心管。从离心管转移细胞到15ml的无菌离心管中，并加入10 ml生长的Medi嗯。 离心细胞，在200×g离心5分钟，在室温下和吸出上清液，以除去残留的DMSO。 重悬细胞沉淀用完全生长培养基中，将细胞转移至75 厘米的烧瓶中。加生长培养基至总体积为约20-25毫升，孵育37℃/ 5％CO 2在。 每天目视检查的汇合细胞培养与媒体的变化，每两天。一般于2-4天，电池将达到80-90％汇合，届时他们将准备在流室法的使用。 要准备培养皿，将在流室中使用（见第5章），加入1毫升10微克/毫升纤维连接蛋白和0.05％（W / V）明胶为35 mm组织培养皿和吸管数次，使确保整个板表面涂。除去多余的纤连蛋白和明胶溶液和空气干燥该板为至少30分钟，以优化蛋白基质的形成。该fibronectin和明胶溶液可以重复使用高达10倍。 按照步骤1.5-1.7描述使用胰蛋白酶-EDTA从步骤2.2收获HUVEC细胞。种子500,000细胞到每个包被的组织培养皿中。加入2ml生长培养基中每道菜，并培育37℃/ 5％CO 2的。 使细胞生长至汇合，如步骤2.2。细胞应进行外观与媒介改变了每两天每天检查。在此之前的流室法，首要的HUVEC与20毫微克/毫升的人TNF-α的4-6小时上调，刺激黏附分子的表达。 3，纯化配体涂层吸取0.5厘米直径的一个圆在35毫米组织培养皿的中心标记或钢笔。 板20微升的标志区20微克/毫升的蛋白A。用枪头传播蛋白A的解决方案，以支付0.5厘米直径的圆内的整个区域。但千万不要触摸或刮伤D的表面是很重要的十岁上下。在37℃下1小时。 用1毫升的PBS（pH 8.0）中洗蛋白A涂板3次。 板加入50μl的1％BSA中的显着区域来阻止在板的非特异性结合。孵育2小时，在4℃下用1毫升的PBS中，如步骤3.3洗阻断板3次。 准备的Fc粘附受体配体嵌合蛋白溶液的涂层。在该实验中，一个ICAM-1/Fc的嵌合体溶液在25微克/毫升和P-Selectin/Fc嵌合体在PBS中0.5微克/毫升（pH8.0）中被使用。 大衣与50微升底物的显着区域。孵育过夜，在4℃下烹调应在两天内被使用，并且涂覆区域不应该被允许干燥。如果要保持上盘的50微升的溶液加入PBS。 4，中性粒细胞分离（在室温下进行所有步骤） 获得知情同意后，收集参与者的血液通过静脉切开成Ñ​​抗凝血液收集管或真空采血管（EDTA或肝素）。采血后，分离前稀释血液1:1的PBS。 准备一个两层聚蔗糖的50毫升离心管中分离外周血单个核细胞和中性粒细胞。首先添加15毫升沉重聚蔗糖（见材料清单，ρ= 1.118-1.120），然后仔细层10毫升光聚蔗糖（见材料清单，ρ= 1.077-1.080）在沉重的聚蔗糖的顶部。应的光聚蔗糖和沉重的Ficoll层之间的尖锐边界。最后，小心层25毫升稀释血样品上的光的Ficoll的顶部，而不会干扰的Ficoll层。 离心管中，在250×g离心30分钟，在室温下进行。注：该离心机转子制动应该关闭这些自旋尽量减少在转子减速的细胞分离的离心年底的潜在干扰。离心后，将下面的层（从顶部到底部）存在：顶层是等离子体福卢由PBMC层上的光的Ficoll层的顶部周三，嗜中性粒细胞层用少量的红血细胞（RBC）的轻和重的Ficoll随后在管的底部重的Ficoll层和红细胞之间。 收获和嗜中性粒细胞层转移到新的50ml管中有一个移液管，加PBS至50ml离心终体积在225×g下在室温下10分钟。 离心后，仍可能存在的RBC与嗜中性粒细胞混合。吸出上清液下至10ml刻度。通过管（或短暂低速涡旋）的温和搅拌悬浮的嗜中性粒细胞 – 红细胞沉淀，然后用50ml的PBS再次洗涤。 第二次洗涤后，吸出上清液。以除去污染的红细胞，通过搅拌（或短涡旋）重新悬浮沉淀的细胞中残留的PBS中，加入25毫升水2 O，轻轻涡旋10秒以裂解红细胞。 取25 mL 1.8％NaCl溶液中，并立即混匀通过离心分离，在225×g下在室温下10分钟。所述污染红细胞现在应该裂解留下白色中性粒细胞沉淀。 用PBS洗中性粒细胞的细胞沉淀。 重悬分离的嗜中性粒细胞在RPMI培养基中含有10％FBS，并确定光学显微镜用血细胞计数下将细胞浓度。 调整细胞密度至500,000个细胞/ ml用完全RPMI-10％FBS的培养基中。 5，流室粘附实验装配流动室。将包含在显微镜上表中的融合内皮细胞或纯化的粘附受体的配体35毫米的菜。连接平行板流动腔与注射泵，真空系统，留下一行开的中性粒细胞输入。将流动室上盘的顶部，并拧紧流室组件13。 （ 见图1） 启动电脑连接吨的视频录制程序Ø显微镜。调整显微镜的领域和焦点，直到一个明确的字段具有完全生长的HUVEC细胞或一个字段内的配体涂层区域是可见的。 使用注射泵，冲洗液流腔的RPMI培养基中。确保有室之内没有气泡或中性粒细胞输入线。 如果需要的话，嗜中性粒细胞可引发的低剂量（10 -8 M）的fMLP 10分钟。这将允许为不同的供体14之间的中性粒细胞活化的基础水平的匹配。 使用注射泵，以嗜中性粒细胞注入到流动室中限定的速度（350微升/分钟的速度，这等于1.5达因/厘米2的剪切应力是用在本研究中）。录制视频。因为中性粒细胞粘附可发生迅速，具有4-5分钟长度的视频通常是足够的定量粘附事件进行分析。 贴壁细胞被定义为移动小于1细胞直径的小区5秒内对血管内皮细胞或配体涂层表面15,16。计数贴壁细胞的总数量在该领域目前在使用这个法则录制的视频。通过记录长度相似的影片，不同的捐助者的嗜中性粒细胞，就可以计算出贴壁细胞/分钟比较不同供体之间的粘合性。

Representative Results

嗜中性粒细胞的实例结合到纯化的配体（ICAM-1/P-Selectin）涂覆的流室（ 图2），嗜中性粒细胞结合到HUVEC涂覆流动腔实验（ 图3）或显示正在。如图所示，在图中，嗜中性粒细胞中不断积累/连续流动的条件下，附着在涂层表面或血管内皮细胞。根据我们的典型的实验条件下，我们可以观察到50-70人中性粒细胞牢固地附着在涂层表面或HUVEC在一个四分钟的记录时间。然而，嗜中性粒细胞粘附分子，或在衬底（纯化的配体或HUVEC）的等位变体的等位基因变体，可以显着地改变量化中性粒细胞粘附14。 我们还评估了时间在我们的研究中观察到的中性粒细胞粘附事件的依赖性。虽然我们维持恒定流量的条件下，它可能是细胞的粘合性能随时间而改变。 ħH但是，在我们的研究时间比较短的课程，我们没有观察粘连随时间的速度保持一致的任何差异。例如，评估黏附在1-2分钟的时间点相比，附着力3-4分钟的时间点之间观察到的是不是一致的不同。当然，如果粘附实验过程中被刺激的细胞，然后在一段时间内粘合性能的变化可以预期。 在我们的研究中，我们故意灌注细胞低剂量的fMLP（10 -8 M）为研究前10分钟控制了隔离引起的中性粒细胞活化。内皮细胞（HUVEC在我们的研究中）也需要事先激活上调黏附分子的表达以获得最佳白细胞牢固粘连。在没有预处理的，内皮细胞（HUVECs）将支持非常小的中性粒细胞粘附。在我们的研究中，我们使用10纳克/毫升TNFα的治疗在使用前4-6小时。 IL-1β（10毫微克/毫升）和脂多糖（0.5-1微克/毫升），也可用于预激活的内皮细胞。重要的是，未经处理的HUVEC可作为阴性对照，以确保细胞的粘附是由特定的（受体介导的）的中性粒细胞 – 内皮细胞相互作用。可替代地，抗受体抗体可用于阻断特异性受体，以评估粘附特异性。 在显微镜舞台上图1。流室的配置。 请点击此处查看该图的放大版本。 oad/51410/51410fig2.jpg“/> 0时间点，B：1分钟的时间点，C：2分钟的时间点和D。中性粒细胞粘附在不同时间点（A至ICAM-1/P-Selectin涂层表面的样本视频图2的屏幕快照 ： 4分钟的时间点）。 ICAM-1的浓度为25微克/毫升和P-选择素是0.5微克/毫升。中性粒细胞流速为350μL/分钟，为50万个/毫升中性粒细胞密度。 图3屏幕截图从嗜中性粒细胞粘附到血管内皮细胞表面的涂层在不同时间点（A：0时间点，B：1分钟的时间点，C：2分钟的时间点，和D：4分钟的时间点） 的一个样本视频 。中性粒细胞流速为350微升/毫升50万个细胞/ ml中性粒细胞密度。 种类位置剪切应力（达因/厘米2） 人的常见caroid动脉 11.6 人的鳃动脉 6.5 人的普通股动脉 4.3 人的肾上主动脉 7.3 人的 Supraceliac主动脉 4.2 人的浅表fermoral动脉 4.4 人的静脉 0.5-5.0 人的视网膜动脉第一 40.2 人的视网膜动脉第二 0.001 人的视网膜静脉第一 23.2 人的视网膜静脉第二 0.43 狗常见caroid动脉 15.8 兔子常见caroid动脉 23.3 鼠常见caroid动脉 46.​​6 鼠标常见caroid动脉 64.8 狗普通股动脉 9.8 兔子普通股动脉 156.8 鼠普通股动脉 65.9 表1样品的剪切应力在不同器官和不同的物种。 *摘自参考文献13，16，19，和20。

Discussion

该协议将引导微创激活中性粒细胞的剪切应力条件下谨慎量化中性粒细胞粘附的分离和隔离。中性粒细胞粘附是在炎症的关键过程。因为在这一过程中的多个分子的遗传变异已经证明易患自身免疫病^1,2的发展，一种能够定量地评估人类嗜中性粒细胞牢固粘附的测定系统是必需的。在本协议中所述的方法，允许细心和定量测定中性粒细胞在剪切应力下控制在体外环境中的公司胶粘剂潜力。这种方法从而允许基因型个体之间的定量中性粒细胞粘附的直接比较，以确定遗传变异的粘附分子¹⁴的重要性。

在这种方法的几个步骤，值得慎重考虑achievË高度量化和可重复性的结果。在血管内皮细胞的准备，关键是利用他们在流动室前达到100％的细胞汇合。对于使用涂有纯配体的表面，基材涂布面积不应该被允许干，以避免变性的配体。此外，人中性粒细胞的制备是将实验的成功至关重要。在从血液中分离嗜中性粒细胞的主要问题包括通过最小化的涡流，以避免活化，保持细胞在室温下（ 即血液不应该被储存在冰上和离心步骤应在室温下进行），并在完成隔离和实验轻轻处理在最短的时间成为可能。还有，也可用于制备细胞用于这些测定^17,18附加的嗜中性粒细胞的分离方法。

使用新鲜分离的人中性粒细胞的实用角度出发，附着测定应在3-6小时参与者放血后启动。嗜中性粒细胞是处理极为敏感，抽血和使用之间的时间延长可能会影响检测结果。前向流室法仔细测定中性粒细胞浓度的也是必要的，以实现准确和可重复的结果。

在流室法，仔细监视录像，以确保流动速率是一致的，有在整个实验的长度没有湍流是重要的。改变流速或湍流的存在下，将须，该实验重复进行。在实验后，这也很重要，以评估剩余的中性粒细胞在显微镜以确保该嗜中性粒细胞不结块。结块此时将表明，嗜中性粒细胞已成为激活从而在实验过程中可以显著改变嗜中性粒细胞的密度。

内容“>流动室产生腔室中的接近均匀的剪切应力（τ=6Qμ/（WH ^2），其中Q =流速，μ=动态粘度和流动室W =宽度，下h =高度流腔^15），在我们的研究中，我们使用的350微升/分钟的中性粒细胞粘附的流速，从而产生1.5达因/厘米²的剪切应力（瓦特= 0.25厘米，H =0.01英寸，水的粘度在37℃（0.007泊）用作RMPI介质的粘度的近似值），对于一个特定的流室，可以改变流率，以实现不同程度的剪切应力，以模拟不同的生理条件下，典型的生理剪切应力在人类血管可之间0.5-5.0达因/厘米的范围^13,16。剪应力在其他的血管和其他动物被列于表1 ^{113,16,19 20。}

而我们的方法集中于人类中性粒的附着性的研究LS，这个方法并不限于嗜中性粒细胞，并且可以很容易地应用于粘接或用简单的修改的其它细胞类型的轧制研究。此外，在该方法的基底可以为不同的目的而改变。

虽然这个协议是很容易适应不同的研究，有一定的局限性。因为在这里实现该协议要求大量的原代细胞进行分析。这可能会妨碍从小型动物的原代细胞的分析。此外，需要固定化的纯化的配体粘附在主动/可用的构象可能限制配体的范围。用Fc融合蛋白的大大增强了板表面上实现适当的配体构象的可能性。尽管如此，我们的方法具有显著的灵活性，允许的粘附事件的定量分析。这些研究将大大提高我们的理解粘附受体 – 配体对的，和遗传变异的潜在功能的重要性在这些蛋白质在人类疾病的发病机制。

Materials

Table of Reagents Materials
Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
0.25% Trypsin/EDTA	Life technologies	25200-056	with Phenol Red
2X Trypsin inhibitor	Life technologies	R-002-100
35mm tissue culture dish	Corning Inc.	430165	Standard Tissue Culture Treated Surface
75cm2 tissue culture flask	Corning Inc.	430641	Standard Tissue Culture Treated Surface
CCD camera	Dage-MTI	Model 300T-RC
Cell freezing container	Biocision	BCS-045
EBM-2	Lonza Inc.	CC-3156	HUVEC growth basal medium
EGM-2 Bulletkit	Lonza Inc	CC-4176	HUVEC growth factors for basal medium
FBS	Life technologies	10082-147	Certified, Heat Inactivated
Gelatin	Sigma	G9391	from bovine skin
Hemacytometer	Fisher scientific	02-671-51B
Fibronectin	Sigma	F2006	from human plasma
Flow chamber	Glyco Tech	31-001	Circular flow chamber for 35mm dishes
fMLP	Sigma	47729
Histopaque-11191	Sigma	11191	Heavy ficoll
HUVEC	Lonza Inc.	CC-2517A
ICAM-1	R&D systems	720-IC	Fc chimera
Lymphocyte separation medium	Mediatech Inc.	25072CV	Light ficoll
Microscope	Zeiss	Axiovert 100
RPMI 1640 medium	Life technologies	11875	with L-Glutamine and Phenol Red
Protein A	Sigma	P6031	resuspend in PBS
P-Selectin	R&D systems	137-PS	Fc chimera
Syringe pump	KD Scientific	KDS270
TNF-a	Life technologies	PHC3015	Recombinant Human Protein
Trypan Blue Solution, 0.4%	Life technologies	15250-061