β-catenin의 저하의 재구성<em> Xenopus의</em> 계란 추출
Summary
방법은 Xenopus의 계란 추출물 및 단백질 분해의 저분자 변조기에 대한 고 처리량 스크리닝을 위해 그 적응 방사성 표지와 루시퍼 라제 융합 단백질을 이용하여 단백질 분해 분석에 대해 설명한다.
Abstract
는 Xenopus laevis의 계란 추출물. Xenopus의 계란 추출물이 세포주기 및 신호 전달 경로 1-3 포함하여 많은 세포 맥락에서 단백질 회전율을 연구하는 데 사용 된 다양한 세포 과정의 생화학을 공부 잘 특징으로, 강력한 시스템입니다. 여기서, 방법이 중요한로 Wnt 경로의 구성 요소, β-catenin의의 분해를 촉진하기 위해 최적화 된 Xenopus의 계란 추출물을 분리에 설명되어 있습니다. 두 가지 방법은 Xenopus의 계란 추출물에서 β-카테닌 단백질 분해를 평가하기 위해 설명되어 있습니다. 다른 하나는보다 쉽게 높은 처리량 분석 (반딧불 루시 페라 제 – 태그 융합 단백질)에 대해 조정하는 동안 한 가지 방법은, ([35 S] – 방사성 표지 단백질) 시각 정보를합니다. 설명 된 기술은 β-카테닌 단백질 회전율을 평가하고 해당 매출에 공헌 분자 구성 요소를 식별하는 데 사용될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 또한 ABIL루시 페라 제 – 태그 단백질의 양적 및 손쉬운 판독과 함께 균일 한 Xenopus의 계란 추출물의 큰 볼륨을 정화하는 ITY이 시스템은 쉽게 β-catenin의 분해 변조기에 대한 높은 처리량 검사에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
는 Xenopus laevis의 계란 추출물은 세포 골격 역학, 핵 조립 및 수입, 세포 사멸, 유비퀴틴 대사, 세포주기의 진행, 신호 전달, 단백질 회전율 1-17를 포함하여 많은 세포 생물 학적 과정을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 계란 추출물은 본질적으로 이러한 프로세스를 실행하고 조사를 활성화하는 데 필요한 모든 필수 세포질 구성 요소가 포함되어 희석 세포질을 나타 내기 때문에 Xenopus의 계란 추출물 시스템은 세포 프로세스의 군단의 생화학 적 분석에 대한 의무입니다. 계란 추출물 많은 양의 물질 (예, 단백질 정제 또는 고 처리량 스크리닝) 18-20의 많은 양을 필요로 생화학 적 조작에 대해 한 번에 제조 할 수있다. 또 다른 장점은 Xenopus의 계란 추출물에서 특정 단백질의 농도가 정확하게 재조합 단백질 및 / 또는 endog immunodepletion의 첨가에 의해 조절 될 수 있다는 것이다또한 단백질의 발현을 제어하기 어렵다 플라스미드 DNA의 형질 대조적 enous 단백질. 또, 사용 가능한 재조합 단백질의 결여는 외생 첨가 mRNA의 번역을 위해 새로 제조 Xenopus의 계란 추출물의 고용량을 활용 관심 단백질을 코딩하는 전 사체의 첨가에 의해 극복 될 수있다.
단백질 분해의 규제는 많은 세포 경로의 조절에 중요합니다 21. Xenopus의 계란 추출물이 시스템은 전사와 번역의 혼란의 영향없이 단백질 회전율을 모니터링 할 수있는 여러 가지 방법에 대해 허용하는 단백질 분해를 연구하기 위해 광범위하게 사용되어왔다을 처리합니다. Wnt 신호 전달 경로 개발과 질병에 중요한 역할을 담당하고 매우 보존 신호 통로입니다. β-카테닌,이 Wnt 경로의 주요한 효과기의 회전율은 매우 증가 된 정상 상태 L에게 규제되고,β-catenin이의 거시기는이 Wnt 표적 유전자의 활성화를 위해 중요합니다. β-catenin의 분해의 중요성은 β-catenin의 분해를 억제로 Wnt 경로에 돌연변이가 ~ 대장 암 (22)의 모든 산발적 인 케이스의 90 %에서 발견되는 사실에 의해 강조 표시됩니다. 이 Wnt 경로의 구성 요소에 의한 β-catenin의 저하가 충실히 매출의 메커니즘을 연구 할뿐만 아니라 분해 2, 19, 20, 23 ~ 29의 새로운 작은 분자 변조기를 식별하는 Xenopus의 계란 추출물에 효과적으로 요약 할 수있다.
세포주기를 공부 Xenopus의 계란 추출물의 제조 방법은 이전 조브 공보 30-32에 기술되었다. 현재 프로토콜은 이러한 방법의 변형을 설명하고의 분해에 최적화되어 있습니다 [35 S] – 방사성 표지 된 β-catenin의와 루시 페라 제 – 태그 β-catenin이있는Xenopus의 계란 추출물. 방사성 동위 원소 분해 분석은 오토 라디오를 통해 단백질 수준을 직접 시각화 할 수 있습니다. [35 S] 메티오닌이어서 직접 분해 반응에 첨가 될 수있는 시험 관내 번역 반응을 사용하여 관심의 단백질에 도입된다. 또한, 방사성 표지 단백질 회전율 분석은 단백질 안정성에 영향을 미칠 수있는 그 단백질 또는 에피토프 태그에 대한 항체를 요구하지 않는다. 단백질 수준에서도 작은 변화, 방사성 표지 된 단백질 밴드의 강도의 변화에 반영 용이 오토 라디오 그래피에 의해 시각되므로 [35 S]를-방사성 표지 분해 분석은 단백질 회전율이 시각화를위한 매우 유용한 방법을 나타낸다.
순서 반딧불 루시페라아제에 β-카테닌의 퓨전 (이하, 간단히 「루시퍼 "라 함), 단백질 수준의 정밀하고 손쉬운 정량적 측정을 허용β-catenin의 회전율 19, 20의 운동 특성을 결정합니다. 루시퍼 라제 분석의 주요 장점은 쉽게 확장되어 강한 양적 시스템을 제공한다는 것이다. 다음 프로토콜은 β-catenin의 분해 및 신규 β-catenin의 변조기의 높은 처리량 검사를위한 강력하고 효율적이며 효과적인 방법을 시금위한 간단한 방법을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenopus의 계란 추출물은 β-catenin의 회전율을 조사하기위한 강력한 생화학 적 시스템입니다. Xenopus의 계란 추출물의 β-catenin의 농도는 ~ 25 nm의 2입니다. 최적의 조건 하에서, 계란 추출물은 50 ~ 100 ㎚ / hr의 속도로 β-카테닌을 저하 할 수 있고 200에서 24 nM의 최대량의 절반이다. Xenopus의 계란 추출물을 사용하여 β-catenin의 분해를 성공적으로 재구성에 대한 몇 가지…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 중요한 읽기 로리 리 감사합니다. TWC는 미국 심장 협회 (American Heart Association) Predoctoral 원정대 (12PRE6590007)에 의해 지원된다. MRB는 국립 암 연구소 교육 교부금 (T32의 CA119925)에 의해 지원된다. SSH는 건강의 국립 연구소 (R01DK078640)에 의해 지원된다. EL는 건강의 국립 연구소 (R01GM081635 및 R01GM103926)에 의해 지원된다.
Materials
| Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium Chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 mL syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27G1 needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo Luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20 |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-Firefly Luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16°C Incubator | Percival Scientific |
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