β-カテニンの分解にの再構成<em>アフリカツメガエル</em>卵抽出
Summary
方法は、 アフリカツメガエル卵抽出物およびタンパク質分解の小分子モジュレーター用のハイスループットスクリーニングのために適応で放射性標識、ルシフェラーゼ融合タンパク質を用いてタンパク質分解を分析するために記載されている。
Abstract
アフリカツメガエルの卵抽出物は、 アフリカツメガエル卵抽出物は、細胞周期、シグナル伝達経路1-3を含む多くの細胞の文脈において、タンパク質の代謝を研究するために使用されている多様な細胞プロセスの生化学を研究するための十分に特徴付けられた、堅牢なシステムである。本明細書では、本方法は、クリティカルWnt経路成分、β-カテニンの分解を促進するために最適化されたアフリカツメガエル卵抽出物を単離するために記載されている。二つの異なる方法が、 アフリカツメガエルの卵抽出物中のβ-カテニンタンパク質の分解を評価するために記載されている。他方はより容易にハイスループットアッセイ（ホタルルシフェラーゼタグ融合タンパク質）のためにスケーリングされている間の一つの方法は、（[35 S] -放射性標識された蛋白質）を目視有益である。記載された技術は、β-カテニンタンパク質の代謝回転を評価し、その代謝回転に寄与する分子成分を同定に使用することができるが、これらに限定されない。さらに、ABILルシフェラーゼ標識タンパク質の定量的かつ容易な読み出しと組み合わせた均質なアフリカツメガエルの卵抽出物を大量に精製するITYは、このシステムを簡単にβ-カテニンの分解の調節因子のためのハイスループットスクリーニングに適合させることができるようになります。
Introduction
アフリカツメガエルの卵抽出物は、細胞骨格の動態、核アセンブリおよびインポート、アポトーシス、ユビキチン代謝、細胞周期進行、シグナル伝達、およびタンパク質代謝回転1-17を含む多くの細胞生物学的プロセスを研究するために広く使用されている。卵抽出物は、これらのプロセスを実行し、調査を可能にするために必要な全ての必須細胞質成分が含まれている基本的に希釈されていない細胞質を表すので、アフリカツメガエル卵抽出システムは、細胞プロセスの軍団の生化学的解析に適している。卵抽出物の大量の材料（ 例えば 、タンパク質精製、高スループットスクリーニング）18-20を大量に必要とする生化学的な操作のために、一度に製造することができる。別の利点は、 アフリカツメガエルの卵抽出物中の特定のタンパク質の濃度を正確に組換えタンパク質および/ または内因の免疫除去を添加することによって調節することができることである関心対象のタンパク質の発現を制御することが困難であるプラスミドDNAのトランスフェクションとは対照的にenousタンパク質。また、利用可能な組換えタンパク質の欠如は、外因的に添加されたmRNAを翻訳するための新たに調製したアフリカツメガエルの卵抽出物の高容量を利用して、目的のタンパク質をコードする転写物を添加することによって克服することができる。
タンパク質分解の調節は、多くの細胞経路の制御に重要であり、21を処理する。 アフリカツメガエル卵抽出物は、システムが、転写および翻訳の影響を交絡することなく、タンパク質の代謝回転を監視するための複数の方法を可能にするように、タンパク質分解を研究するために広く使用されている。 Wntシグナル伝達経路の開発および疾患において重要な役割を果たしている高度に保存されたシグナル伝達経路である。 β-カテニンの代謝回転、Wnt経路の主要なエフェクター、高度に規制され、増加した定常状態リットルβ-カテニンのevelは、Wnt標的遺伝子の活性化に重要である。 β-カテニンの分解の重要性は、Wnt経路の変異は大腸癌22の全ての散発例の約90％に見β-カテニンの分解を阻害しているという事実によって強調されている。 Wnt経路の成分によるβ-カテニン分解を忠実そのターンオーバーのメカニズムを研究するため、ならびにその分解2、19、20、23-29の新規な小分子モジュレーターを同定するためにアフリカツメガエルの卵抽出物中で要約することができる。
細胞周期を研究するためのアフリカツメガエル卵抽出物の調製のための方法は、以前のJoveの刊行物30-32に記載されている。現在のプロトコルは、これらの方法の変更を説明し、[35 S] -放射性標識されたβ-カテニンとルシフェラーゼタグ付きβ-カテニンの分解に最適化されていますアフリカツメガエルの卵抽出物。放射性標識分解アッセイは、オートラジオグラフィーを介してタンパク質レベルの直接可視化を可能にする。 [35 S]メチオニンを直接分解反応に添加することができるインビトロ翻訳反応を用いて目的のタンパク質に組み込まれる。さらに、放射性標識タンパク質の代謝回転アッセイは、目的のタンパク質又はタンパク質安定性に影響を与えることができるエピトープタグに対する抗体を必要としない。タンパク質レベルの小さな変化は、放射性標識されたタンパク質バンドの強度の変化に反映されるように、容易にオートラジオグラフィーによって可視化されるので、[35 S]-放射性標識分解アッセイは、タンパク質代謝回転2の可視化のための非常に有用な方法を示している。
ために、ホタルルシフェラーゼにβ-カテニンの融合体（以下、単に「ルシフェラーゼ」という）、タンパク質レベルの正確で容易な定量的測定を可能にするβ-カテニンターン19,20の動力学的特性を決定する。ルシフェラーゼアッセイの主な利点は、それが容易にスケールアップされている強力な定量的なシステムを提供することである。以下のプロトコルは、β-カテニン分解および新規なβ-カテニンモジュレーターのハイスループットスクリーニングのための、堅牢で効率的、かつ効果的な方法をアッセイするための簡単な方法を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
アフリカツメガエルの卵抽出物は、β-カテニンの離職率を調査するための堅牢な生化学システムです。 アフリカツメガエルの卵抽出物中のβ-カテニンの濃度は約25 nMの2である。最適な条件下では、卵抽出物は、50〜100 nMの/時の速度でβ-カテニンを分解することが可能であり、200 nMの24で最大の半分である。 アフリカツメガエルの卵抽出物を使用して、β-?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿の重要な読書のためのローリー·リーに感謝します。 TWCは、米国心臓協会博士号を取得する前のフェローシップ（12PRE6590007）でサポートされています。 MRBは、国立がん研究所の訓練助成金（T32のCA119925）によってサポートされています。 SSHは国立衛生研究所（R01DK078640）でサポートされています。 ELは、国立衛生研究所（R01GM081635とR01GM103926）によってサポートされています。
Materials
| Name of Reagent/ Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium Chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium Chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 mL syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27G1 needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo Luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80, can store for up to 1 month at -20 |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 High-yield Wheat Germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express Protein Labeling Mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 mL Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-Firefly Luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| Name of Equipment | Company | ||
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16°C Incubator | Percival Scientific |
Riferimenti
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