La presenza di HPV ad alto rischio in testa e del collo tessuto tumorale è associata a esiti favorevoli. L'RNA recentemente sviluppato nella tecnica di ibridazione in situ chiamata RNAscope permette la visualizzazione diretta di HPV E6/E7 mRNA in sezioni di tessuto FFPE.
Il 'gold standard' per la rilevazione di HPV oncogeni è la dimostrazione di trascrizionalmente attivo HPV ad alto rischio nel tessuto tumorale. Tuttavia, l'individuazione di E6/E7 mRNA da parte quantitativa trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (qRT-PCR) richiede l'estrazione di RNA che distrugge il tessuto tumorale contesto critico per la correlazione morfologica ed è stato difficile da adottare nella pratica clinica di routine. Il nostro RNA recentemente sviluppato di tecnologia situ ibridazione, RNAscope, permette la visualizzazione diretta di RNA in, inclusi in paraffina (FFPE) tessuto fissato in formalina con la sensibilità di singola molecola e la risoluzione singola cellula, che consente altamente sensibile e specifica analisi in situ di un biomarker RNA in campioni clinici di routine. Il saggio RNAscope HPV è stato progettato per rilevare la E6/E7 mRNA di sette genotipi HPV ad alto rischio (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58) con un pool di sonde genotipo-specifici. Si è dimostrato eccellente sensibilitàe specificità contro l'attuale metodo 'gold standard' per l'individuazione di E6/E7 mRNA da qRT-PCR. Stato determinato da HPV RNAscope è fortemente prognostico di outcome clinico nei pazienti con cancro orofaringeo.
Conti di papillomavirus umano ad alto rischio (HR-HPV) per circa il 5% di tutti i tumori in tutto il mondo 1. L'incidenza del cancro orofaringeo HPV-associata è aumentata negli ultimi decenni, soprattutto tra gli uomini. Orofaringeo a cellule squamose HPV-positive (OPSCC) probabilmente costituirà la maggioranza di tutti i tumori della testa e del collo negli Stati Uniti nei prossimi 20 anni 2. Orofaringei carcinomi a cellule squamose causati da HPV sono associati con la sopravvivenza favorevole, e lo stato del tumore HPV è un fattore prognostico forte e indipendente per la sopravvivenza 3.
Prove per l'attivazione trascrizionale di oncogeni virali E6 ed E7 è considerato il gold standard per la presenza di HPV clinicamente rilevante 4. Tuttavia, la scoperta di E6/E7 mRNA da tessuto tumorale fresco mediante tecnica RT-PCR non è pratico nella pratica clinica ed è stato limitato ai laboratori di ricerca. Recentemente, abbiamo HAVe ha sviluppato una nuova tecnologia chiamata RNA ISH RNAscope, che consente il rilevamento multiplex in celle singole, con il singolo di RNA sensibilità molecola nei campioni in formalina paraffina fissati incorporati tessuti (FFPE) 5-10. Abbiamo fornito tre linee di evidenza per singola molecola di rilevamento 5. In primo luogo, la progettazione e segnale del sistema di amplificazione sonda RNAscope permesso di rilevamento singola copia genomiche HER2 bersagli di DNA in HeLa e SK-BR-3 linee cellulari. In secondo luogo, se confrontato con HER2 segnali di DNA genomico, la distribuzione delle intensità di fluorescenza di punti di segnale HER2 mRNA in cellule HeLa era coerente con una molecola per punto. In terzo luogo, il numero di punti di segnale HER2 mRNA per cella corrisponde strettamente il numero di copie HER2 mRNA stimato mediante un saggio quantificazione basata soluzione, sostenendo ulteriormente rilevamento singola molecola. Inoltre, di contrasto dei nuclei con DAPI in microscopia a fluorescenza o con ematossilina in microscopia in campo chiaro permette la visualizzazione dei singoli nuclei, which a sua volta consente il rilevamento e la quantificazione degli obiettivi di RNA su base singola cellula 10. La capacità di analizzare l'espressione genica in situ in campioni clinici di routine rende RNAscope una piattaforma promettente per patologia diagnostica, in particolare quelli di tessuto FFPE sezione basata saggi 10,11. Abbiamo sviluppato un saggio basato HPV-RNAscope per rilevare E6/E7 mRNA di sette genotipi ad alto rischio di HPV (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, e 58) utilizzando un pool di sonde genotipo-specifici. I nostri recenti studi in OPSCC hanno dimostrato che il saggio RNAscope HPV è altamente sensibile e specifico per determinare lo stato di HPV sui tessuti FFPE 12-17, e anche informa la prognosi in OPSCC 12,16.
Il principio della tecnologia RNAscope è stato descritto in precedenza 5. Qui, descriviamo il protocollo completo di analisi RNAscope e dimostrare il suo utilizzo nella rilevazione di HR-HPV in FFPE sezioni di tessuto tumorale.
Il test HPV RNAscope permesso la visualizzazione diretta di E6/E7 mRNA in situ in testa HPV-associata collo e carcinoma a cellule squamose. Il saggio RNAscope è pienamente compatibile con il tessuto tumorale fisso di routine e conserva la morfologia del tessuto per correlazioni istopatologiche (Figura 2). Uno dei principali vantaggi del test RNAscope rispetto ai metodi convenzionali CISH è che amplifica specificamente i segnali di ibridazione (Figure 2B e 2E), senza amplificare il rumore di fondo (Figure 2C e 2F).
In pratica, la procedura di analisi RNAscope HPV può essere completato entro 8 ore o comodamente divisa in due giorni. Il saggio RNAscope HPV è stato utilizzato per determinare lo stato di HPV in testa e del collo carcinoma a cellule squamose 12-16, dimostrando il 97% di sensibilità e specificità del 93% utilizzando qRT-PCR come metodo di riferimento 16. Chr convenzionaleISH omogenic per HR-HPV DNA è altamente specifica, ma ha una sensibilità del 12 ~ 80%. Immunoistochimica (IHC) colorazione per il cellulare surrogato marcatore p16 dimostra sensibilità eccellente, ma può generare risultati falsi positivi 15,18, soprattutto in nonoropharyngeal tumori testa e collo 15. L'attuale metodo "gold standard" di qRT-PCR per l'HPV E6/E7 mRNA rilevamento richiede tessuto fresco congelato per ottenere risultati ottimali ed è tecnicamente complessa, che ne limita l'utilizzo solo al laboratorio di ricerca. Inoltre, richiede l'estrazione di RNA che rende impossibile correlare espressione HR-HPV E6/E7 mRNA con istopatologia.
Ci sono diversi fattori critici per il successo del saggio RNAscope. In primo luogo, per i migliori risultati, i tessuti dovrebbero essere fissati in fresco 10% formalina neutra tamponata a temperatura ambiente per 16-32 ore secondo le linee guida ASCO / CAP 19. In secondo luogo, il forno HybEZ è altamente raccomandato in quanto consentonos controllo ottimale della temperatura e dell'umidità per sonda di ibridazione e gradini amplificazione del segnale. In terzo luogo, è importante rimuovere buffer residuo in eccesso prima di ogni passo, ma ancora mantenere la sezione di tessuto da asciugare durante tali operazioni.
La procedura RNAscope manuale qui descritto è stato completamente automatizzato su un vetrino sistema di auto-colorazione commerciali 10. Ciò dovrebbe facilitare notevolmente la standardizzazione delle condizioni di saggio e di risparmiare prezioso lavoro manuale nei laboratori di patologia clinica. Inoltre, il software di analisi di immagine dedicato è stato sviluppato 10 per identificare automaticamente le cellule e segnali di colorazione su un vetrino digitalizzato, che dovrebbe contribuire ad eliminare soggettività e migliorare la riproducibilità nel punteggio.
In sintesi, il saggio RNAscope HPV rileva la presenza di trascritti HR-HPV E6/E7 mRNA in situ nei tessuti FFPE. Ha un flusso di lavoro che è familiare a patologia clinica laboratori per consentire la diretta visualizzazione di questi in sezioni di tessuto. Esso offre una piattaforma ideale per l'esame (FFPE) campioni di tessuto, e può essere facilmente adottata dai laboratori diagnostici di patologia.
The authors have nothing to disclose.
Supportato in parte dal NIH sovvenzione (R43/44CA122444) e DOD BRCP concessione (W81XWH-06-1-0682) per YL.
SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit – Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
Cover Glass 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
Drying Oven | Capable of holding temperature at 60 ± 1°C | ||
Water Bath | Capable of holding temperature at 40 ± 1°C | ||