Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência
Summary
Um protocolo simples para determinar o teor de lípidos neutros de células de algas com um procedimento de coloração com Vermelho do Nilo é descrito. Esta técnica de poupança de tempo, oferece uma alternativa aos protocolos de quantificação de lípidos tradicionais à base gravimétrica. Ele foi projetado para a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos.
Abstract
As algas são consideradas excelentes candidatos para as fontes de combustível renováveis, devido às suas capacidades de armazenamento de lipídios naturais. Monitoramento robusto de processos de fermentação de algas e de triagem para novas linhagens ricas em petróleo requer um protocolo rápido e confiável para a determinação do teor de lipídios intracelulares. As práticas atuais dependem em grande parte de métodos gravimétricos para determinar o teor de óleo, técnicas desenvolvidas décadas atrás, que são demoradas e exigem grandes volumes de amostra. Neste papel, Vermelho do Nilo, um corante fluorescente que foi usado para identificar a presença de corpos de lípidos em vários tipos de organismos, é incorporado um protocolo simples, rápido e fiável para a medição do teor de lípidos neutros de protothecoides Auxenochlorella, um verde alga. O método utiliza o etanol, um solvente relativamente suave, para permeabilizar a membrana da célula, antes da coloração e uma de 96 cavidades de micro-placa para aumentar a capacidade da amostra durante as medições da intensidade de fluorescência. Ele foi projetoed com a aplicação específica do desempenho do monitoramento de bioprocessos. As amostras previamente secas ou amostras vivas de uma cultura de crescimento pode ser utilizado no ensaio.
Introduction
Devido à sua capacidade de armazenar corpos lipídicos sob certas condições de estresse, as algas têm recebido uma grande atenção nos últimos anos como uma potencial fonte de combustível renovável 1,2. Lípidos neutros pode representar mais de 60% do peso seco da célula sob condições de crescimento apropriadas 3. No entanto, a indústria não tem um protocolo padronizado simples, limpo, rápido e confiável para quantificar o conteúdo lipídico de células de algas, a fim de monitorar adequadamente o desempenho de bioprocessos, analisar as culturas, e na tela de novas linhagens.
O método gravimétrico Bligh-Dyer desenvolvido há 50 anos permanece entre as técnicas mais comuns usados hoje 4,5. Enquanto este processo é simples, confiável e fácil de transportar para fora, que é demorada, necessita grandes volumes de amostra, e faz uso de solventes tóxicos. Não é prático para analisar muitas amostras de uma corrida de fermentação ou a triagem para novas linhagens ricas em petróleo. Outros métodos têm been desenvolvido, mas geralmente necessitam de equipamento avançado e não foram normalizados 6.
Uma alternativa que tem atraído uma grande quantidade de interesse é a mancha Nilo Vermelho. Vermelho do Nilo, um corante que fluoresce preferencialmente em ambientes não-polar, foi utilizado para identificar ou quantificar corpos de lípidos em vários organismos incluindo nemátodos 7, 8 leveduras, bactérias e algas 9, 10-19. Técnicas iniciais envolvendo Nilo Red eram na maior parte qualitativa ou semi-quantitativa, combinando a mancha com uma única tina espectrofotometria ou citometria de fluxo. Além disso, algumas classes de algas, tais como algas verdes têm poços com células de espessura, que são principalmente impermeável à do corante, que limitam o alcance da técnica 10.
As recentes melhorias para o método de coloração Vermelho do Nilo foram relatados que ignorar as deficiências iniciais do protocolo 10,11. Coloração das células na presença de um carrier solvente tal como DMSO a 10 ou 10,11 etanol lineariza a relação entre o teor de óleo e de absorção, permitindo medições quantitativos fiáveis. O solvente ajuda a permeabilizar a membrana da célula de modo a que as moléculas de Nile Red pode passar. Além disso, a incorporação de um espectrofotómetro com capacidade de leitura de micro-placa permite protocolos adequados de alto rendimento para a análise quantitativa.
Neste artigo, detalhe um método simples para medir o teor de óleo de células de algas por coloração de culturas com Vermelho do Nilo, na presença de etanol, um solvente leve. A fim de mais precisão representam ruído de fundo nas medições, uma curva padrão relacionando a intensidade de fluorescência para o teor de óleo é desenvolvido utilizando células de algas da composição de óleo conhecidos. O método é adaptado a partir de protocolos publicados anteriormente 10,11. Usando um espectrofotómetro de 96 poços, é capaz de analisar a mesma quantidade de amostras num tha horat levaria dias para monitorar por métodos gravimétricos. Além disso, através da calibração com amostras representativas das espécies de algas desejado este método produz medições relativamente precisas que são directamente interpretável. Existem muitos protocolos descrevendo os métodos de coloração de algas com Nile Red otimizado para diferentes cepas e aplicações; o protocolo aqui apresentado foi desenvolvido originalmente por de la Hoz Siegler et al. 11 para protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus e Scenedesmus oblíquo, embora seja provável adequado para muitas outras espécies e classes. Ele foi projetado com a aplicação específica de desempenho de monitoramento de bioprocessos e funciona igualmente bem para amostras previamente secas e molhadas amostras de uma crescente cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
As algas utilizadas na curva padrão devem ser as mesmas espécies cultivadas sob as mesmas condições experimentais, como os que estão sendo medidos. As mudanças significativas na composição do meio, a técnica de cultivo, e protocolo de coloração pode afectar a intensidade da leitura de fluorescência. Extracção com hexano (descrito nas secções 1 e 2) foi utilizado para determinar o teor de lípidos neutros de amostras usadas na curva padrão. Para as medições da intensidade de fluorescência precisos, to…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer às Ciências Naturais e Conselho de Pesquisa do Canadá Engenharia para a prestação de apoio financeiro para este projeto.
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
Riferimenti
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- . National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -. D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -. H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
