כאן אנו מתארים עיבוד של פרוטוקולים המשמשים כדי לגרום פלסטיות homeostatic בנוירונים לחקר הפלסטיות של קולטני G-חלבון בשילוב astrocytic. לאחרונה משמש כדי לבחון שינויים בקבוצת astrocytic אני mGluRs בעכברים לנוער, ניתן ליישם השיטה למדידת קנה מידה של GPCRs astrocytic השונות, ברקמות של עכברים בוגרים באתרו וin vivo, ולקבל הערכה טובה יותר של הרגישות של קולטני astrocytic לשינויים בפעילות עצבית.
קרוב לשני עשורים של מחקר קבע כי האסטרוציטים באתר וin vivo לבטא קולטנים רבים G-חלבון בשילוב (GPCRs) שיכול להיות מגורה על ידי משדר neuronally שפורסם. עם זאת, היכולת של קולטני astrocytic להפגין גמישות בתגובה לשינויים בפעילות עצבית זכתה לתשומת לב מועטת. כאן אנו מתארים מערכת מודל שיכול לשמש לגלובלי בהיקף של למעלה או למטה קבוצת astrocytic אני metabotropic קולטני גלוטמט (mGluRs) בפרוסות מוח חריפות. הם כללו שיטות על איך להכין פרוסות בהיפוקמפוס parasagittal, לבנות תאים מתאימים לדגירת פרוסה לטווח ארוך, bidirectionally לתפעל תדירות פוטנציאלית, האסטרוציטים עומס פעולה עצבית ותהליכי astrocyte עם Ca 2 + חיווי ניאון, ולמדוד שינויים בפעילות GQ GPCR astrocytic ידי הקלטה astrocyte הספונטני ועורר Ca 2 אירועים + באמצעות מיקרוסקופיה confocal. בעיקרו של דבר, "r סידןoadmap "הוא הניתן לאיך למדוד את הפלסטיות של GPCRs GQ astrocytic. יישומים של הטכניקה ללימוד של האסטרוציטים הם דנו. יש שיש הבנה של אופן שאיתות קולט astrocytic מושפע משינויים בפעילות עצבית השלכות חשובות עבור שניהם הפונקציה הסינפטי הנורמלית, כמו גם הפרעות תהליכים בסיסי נוירולוגיות ומחלות ניווניות.
האסטרוציטים להגיב בתוך שניות לגירוי של תאי עצב או אקסונים עצביים עם עליות Ca cytoplasmic 2 + וכתוצאה מכך כמעט אך ורק מהפעלה של GPCRs GQ astrocytic. לדוגמא, קולטני אצטילכולין מוסקריניים 1, 2 קולטנים קנבינואידים, קולטנים 1A α adrenergic 3, 4, והקבוצה שאני mGluRs (ראה להלן) הם כל תת GQ GPCR astrocytic שחריפות להגיב על פעילות עצבית. הפעלה של קבוצת astrocytic אני mGluRs הודגמה נרחבת ביותר, בעקבות הגירוי של afferents glutamatergic העצבית באתרו (כמו פרוסות בהיפוקמפוס חריפות) 5-7, כמו גם בקליפת מוח עכבר המבוגר in vivo בעקבות גירוי חושי 8. התוצאה של הפעלה של astrocytic GQ GPCR איתות על הביולוגיה והפיסיולוגיה של האסטרוציטים, תאי עצב, או אינטראקציות astrocyte נוירון כבר עניין של ויכוח 9-12. זה יהיה שלשת זמן עד שהפונקציה של איתות קולטן תא העצב לastrocyte מוערך באופן מלא.
למרות שזה ברור שנוירונים יכולים להפעיל קולטני astrocytic תוך שימוש בפרוטוקולים ניסיוניים, יש היבטים של תקשורת קולט נוירון לastrocyte שנותר הבינו היטב. ראשית, הסכום בפועל של פעילות עצבית הנדרשת להפעלת astrocytic GQ GPCRs אינו מוגדר היטב, ושנית, היכולת של קולטני astrocytic להפגין גמישות שימוש תלוי זכתה לתשומת לב מועטת. כדי להתחיל לענות על שאלות אלה, לאחרונה פיתחו פרוטוקול כדי לגרום לשינוי קנה מידה דו כיוונית של קבוצת astrocytic אני mGluRs בפרוסות בהיפוקמפוס לנוער חריפה בתגובה לשינויים ארוך טווח בפוטנציאל פעולה עצבי (AP) תלויים פעילות הסינפטית. בדומה למה שכבר גילה לפלסטיות homeostatic דו כיוונית של קולטנים עצביים גלוטמט ionotropic 13, 14, קבוצת astrocytic אני mGluRs בהיקף של עד עבורמצור llowing של פוטנציאל פעולה עצבי ולקצץ כאשר תדירות פוטנציאל פעולה עצבית מוגברת 15. שינויים מפצים אלה בקולטנים astrocytic ניתן למדוד על ידי הקלטה ספונטנית ועוררו astrocyte Ca 2 + ארעיים ולהשוות את המאפיינים של אירועים אלה לאלה מהאסטרוציטים בתנאי בקרה. בכתב היד הזה, אנו מתארים את המתודולוגיה המלאה לשימוש בפרוטוקול זה, ובכלל זה הכנת פרוסות בהיפוקמפוס, תנאי דגירה חריפים כדי לגרום לשינוי קנה מידה של הקולטן astrocyte, טעינת astrocyte Ca 2 + מחוון צבע, Ca 2 + טכניקות הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal, והשפעות צפויות על astrocyte פעילות GQ GPCR. השפעות צפויות על astrocyte Ca 2 + מאפייני איתות – שיתאימו לאלו שנרשמו בעבר בתאים בתרבית transfected עם רמות ביטוי שונות של GPCRs GQ – מספקים "מפת דרכים" שיכול לשמש במחקרים עתידיים לassay לשינויים כבביטוי GPCR trocytic. ההשלכות ויישומים אפשריים לשימוש בטכניקה זו יתרמו להבנה של אינטראקציות astrocyte עצבי במוח בריא וחולה שלנו.
המודלים דרוג תיארו מייצגים שיטות מעשיות לחקר פלסטיות לטווח הארוך של קבוצת astrocytic אני mGluRs. 2 + אירועי Ca הדמיה ספונטניים ועוררו מספק assay רגיש למדידת שינויים בפעילות GQ GPCR astrocytic, כראיות מוצקות כבר נקבעו שastrocyte Ca 2 + גבהים להתרחש בעקבות שחרורו מIP 3 חנויות R-רגיש במורד הזרם של GQ GPCR הפעלה 10, 12, 17, 18. האחוז של האסטרוציטים באוכלוסייה מגיב לקבוצת אגוניסט אני mGluR והדפוס כגון Ca 2 + תגובות לדווח על שינויים בי mGluRs קבוצה על ידי האסטרוציטים.
הטכניקה הספציפית משמשת לטעינת האסטרוציטים עם Ca 2 + מחוון היא שיקול חשוב בעיצוב של ניסויים כדי לחפש שינויים בפעילות GQ GPCR astrocytic. בולוס טעינה או האסטרוציטים מרובים טעינה בתפזורת, או pטעינת atch מהדק של האסטרוציטים אדם יכולה לשמש לתמונת Ca 2 + ארעיים בהאסטרוציטים. כל אחת מהגישות מציעים יתרונות וחסרונות מסוימים. ישירות מילוי האסטרוציטים עם Ca 2 + מחוון באמצעות מהדק תיקון מאפשר זיהוי חד משמעי של התא כastrocyte ללא צורך בסמן המשני כגון SR-101. משלוח תיקון מהדק של מחוון גם מאפשר הקלטה של Ca 2 + פעילות מתאי astrocytic קטנים כוללים תהליכים סבוכים בסדר, שעלול להיות עמוקים יותר בפרוסה שבו תאים בריאים ועם יותר אינטראקציות שלמות עם סינפסות (תלוי בכוח הלייזר זמין). עם זאת, טעינת תיקון מהדק סובלת מתפוקה נמוכה כמו הנתונים נאספים תא אחד בכל פעם. לטעינה בתפזורת, לעומת זאת, מאפשרת למספר גדול של האסטרוציטים להיות טעון עם Ca 2 + מדד וצלם בו זמנית. עם זאת, רק האסטרוציטים סמוכים לפני השטח (<20 מיקרומטר) של הפרוסה נטענים, בדאגה קשורהים על בריאות תא וסינפסות בשלמותה.
פרוטוקול בולוס טעינת backpressure שהוצג כאן מציע את דרך ביניים, עם קצב העברת נתונים גבוה יחסית והיכולת לפקח על Ca 2 + פעילות עמוקה יותר בתוך פרוסה (40-75 מיקרומטר). גידול משמעותי בשיעור של האסטרוציטים פעילים באופן ספונטני תוך שימוש בטכניקת בולוס הטעינה הוא ציין בהשוואה לטעינה בתפזורת, טוען כי הקשרים בין הסינפסות עצביות ותהליכי astrocytic יותר מלאים 15. עם טעינה טובה, אפשר לעתים קרובות לעקוב אחר Ca 2 + פעילות בתהליכים עיקריים של האסטרוציטים (מידע לא מוצג) או שעלול להיות אפילו קטנים יותר תאים באמצעות מיקרוסקופ 2 פוטונים. עם זאת, טיפול היה צריך להיות מבוצע בהקצאת התהליכים הקטנים לastrocyte מסוים, ככל שהגבולות להשתלב מכתים הרקע ספציפי. חשש נוסף בשימוש בנהלים לטעינה בתפזורת או בולוס טעינה הוא את הצורך במרץ המשנימשתכשך לזיהוי astrocyte. למרות שזה כבר ידוע במשך שנים רבות כי האסטרוציטים מעדיפים לקחת את אסתר AM Ca 2 + מחוונים, סמן המשני SR-101 משמשים לעתים קרובות כדי לוודא את התאים הטעונים כמו האסטרוציטים. SR-101 עשויים בעצמו לשנות את הרגישות הפנימית של נוירונים 29. שימוש בSR-101 מאשש את הצורך לבצע את כל astrocyte Ca 2 + המדידות בTTX להגביל SR-101 השפעות אפשריות על רגישות עצבית. בהנחה ששניהם שליטה וקבוצות ניסוי כוללים SR-101, הסמן בעצמו לא צריך להסביר את תופעות שנצפו בastrocyte Ca 2 + האיתות הבאה מניפולציה ארוך טווח של פוטנציאל פעולה עצבי. SR-101 עשויים להיות יותר של דאגה גבוהה K + ניסויים, עם זאת, כפי שהוא עשוי להפחית את ההבדל בין 2.5 מ"מ K + לעומת 5.0 מ"מ K + אם קצב הירי הבסיסי לא משתנה באופן יחסי.
גישה מאוד מבטיחה לספק Ca 2 + </sup> מחוון להאסטרוציטים התפתחה לאחרונה אשר מציע חלופה אטרקטיבית לגישות מסורתיות יותר באמצעות Ca 2 + צבעים. התקדמות משמעותית נעשה בשנים האחרונות עם אינדיקטורים סידן מקודד גנטי (GECIs) הממוקדים להאסטרוציטים 30-32. GECIs יכול להיות מועבר להאסטרוציטים ידי microinjection vivo של וקטורים ויראליים adeno הקשורים לאזור במוח של עניין, כגון ההיפוקמפוס. ביטוי של GECIs מושגת לאחר כשבועיים בעקבות זיהום ויראלי 32. ישנם יתרונות רבים שהוצגו על ידי השימוש בGECIs בהאסטרוציטים. ראשית, הווקטורים ממוקדות האסטרוציטים באמצעות אמרגן astrocyte הספציפי, כך שהתאים שכותרתו הם האסטרוציטים 32. שנית, רעש אות לעכשיו נראה דומה למה שניתן להשיג באמצעות משלוח תיקון מהדק של צבע, אך ללא הפולשנות של שיש לו פיפטה את תיקון בתא 32. שלישית, המחוונים יכולים להיות דלivered ובא לידי ביטוי ברקמה בוגרת, שהוא בעייתי בשיטות משלוח לטעינה בתפזורת. יתרה, הביטוי פסיפס מציע היכולת להבדיל בקרב האסטרוציטים מרובים. לכן, יכולים להיות צילמו כמה האסטרוציטים פוטנציאליים בו זמנית, גם בעת ההקלטה בסומה וbranchlets בסדר באותו הזמן. לכן, באופן פוטנציאלי טכניקה אחת בודדת יכולה לשמש במקום של שלוש טכניקות נפרדות (לטעינה בתפזורת, בולוס טעינה, וטעינת התיקון-clamp) להקליט פעילות דרוג של GPCRs GQ astrocytic, מאוד להגדיל את היעילות.
חסרון פוטנציאלי אחד של שימוש במשלוח בתיווך נגיפי של Ca 2 + אינדיקטורים להאסטרוציטים הוא ההשפעה האפשרית על בריאות פרוסת 32. הווקטורים ויראליים adeno הקשורים בשימוש, כדי לספק את GECIs הוכחו בעבר לגרום דבק תגובתי של האסטרוציטים 33. הכנת פרוסות המוח באופן כללי סביר להניח יוזמת בשלבים מוקדמים של פתולוגיה כוללים שחרורו של inflammatory מולקולות 10. לכן, בשילוב עם הזמנים ארוכי הדגירה נדרשו כדי לגרום קנה מידה של קולטנים astrocytic, שימוש בGECIs מועבר באמצעות וקטורים ויראליים היית צריך לקבל תמורה נוספת בהקשר של בריאות פרוסה בסוגים אלה של ניסויים.
כאשר העסקת פרוטוקול זה, חשוב לזכור שבזמן היישום לאגוניסט כדי לייצר תגובה ישתנה כפונקציה של זמינות הקולטן. לריכוז מסוים של אגוניסט, זמן היישום יצטרך להיות ארוך יותר אם הקולטנים טפסו למטה, וקצרים יותר אם הקולטנים טפסו למעלה, לסמים כדי להגיע לריכוז מתאים ברקמה להפעלת קולטנים מספיק כדי לייצר Ca 2 + תגובה. לכן, פעמים יישום תרופה, ואפשרות הריכוזים שלהם, ייתכן שתהיינה צורך להיות מותאמות בהתאם לכיוון המיועד של קנה המידה. לדוגמא, ריכוז אגוניסט ייתכן שיהיה הצורך הוריד בגASE של TTX להימנע להרוות תגובות, ועלה לאחר דוגרים פרוסות ב+ K הגבוה אפילו לראות תגובה. באופן ספציפי, ריכוז DHPG הועבר 5-15 מיקרומטר לאחר טיפול TTX ל30-50 מיקרומטר לאחר טיפול 5.0 מ"מ K + על מנת ללמוד 2 + דפוסי תגובת Ca, כ5-15 מיקרומטר היה לעתים קרובות נמוך מדי כדי לייצר תשובות אמינות ב האסטרוציטים לאחר קנה המידה במורד של הקבוצה אני mGluRs.
הקלטה של astrocyte Ca 2 + פעילות לא מספקת עדות ישירה של הכנסת קולט או הפנמה או מקרום הפלזמה. עם זאת, המבוסס על הדמיון המדהים של נתונים עם נתונים ממחקרים קודמים במבחנה שבדקו את הקשר הישיר בין רמות ביטוי GQ GPCR וספונטאניות ועוררו Ca 2 + ארעיים 21-24, הפרשנות ההגיונית ביותר של השינויים בCa 2 + איתות היא שיש לי רמות ביטוי astrocyte משטח קולטהשתנה. גישה משלימה עשויה להיות שיקול חשוב, אם רוצה לספק ראיות נוספות על המקום של ההשפעה על Ca 2 + פעילות. אסטרטגיה שבה השתמש הייתה לבחון את ההשפעה של הדגירה TTX על פרוסות בהיפוקמפוס מעכברי MrgA1R astrocytic. עכברים מהונדסים אלה מבטאים GQ GPCR זר (MrgA1R) רק בהאסטרוציטים. משום שקולטן זה הוא לא האם למוח, אין הנוירוטרנסמיטר אנדוגני הנוכחי כדי לשנות את רמות הפעילות שלה. העבודות קודמות הראו כי קולטן זה עוסק באותו מולקולות איתות תאית כפי שאני mGluRs קבוצת אנדוגני באותו האסטרוציטים 34. דגירה לאחר לטווח הארוך של פרוסות מעכברי MrgA1R בTTX, לא נמצאו הבדלים בתגובות MrgA1R עורר אגוניסט לעומת שליטת littermate מודגרות פרוסות תספק ראיות לכך ההשפעה על astrocyte Ca 2 + הפעילות היא כתוצאה משינויים המקומיים לקולט פני השטח, במיוחד אם תגובות של הקבוצה אני mGluR עדיין signifמשופר icantly באותו האסטרוציטים. אלטרנטיבה, אם כי אסטרטגיה אולי מעורבת יותר תהיה לבודד האסטרוציטים מהפרוסות לניתוח כתם מערבי, כל עוד שבריר קרום יכול להיות מנותח לשינויים ברמות ביטוי הקולטן לפני השטח. מיון תא הקרינה הופעל (FACS) או cytometry זרימה עשוי להיות מועיל כאן.
היישומים האפשריים של שיטה זו למחקר של נוירונים, האסטרוציטים ואינטראקציות astrocyte העצבי הם רבים. בניסויים שלנו, רק קבוצה עוררו DHPG אני mGluR 2 + תגובות Ca astrocytic נחקרו, בפרוסות בהיפוקמפוס חריפות מבודדות מעכברים לנוער. הכנה זו יש לא רק afferents השלמה (בטחונות שפר), אלא גם את תאי עצב שיוצרים אותם (תאים פירמידליים CA3), כך שניתן לתפעל את שיעורי הירי של נוירונים glutamatergic הללו על תאי postsynaptic (תאים פירמידליים CA1) ו האסטרוציטים בradiatum שכבת התהליכים שassociatE עם סינפסות אלה. הפרוסה בהיפוקמפוס חריפה לא יכולה להיות ההכנה הטובה ביותר לטיפול בשיעורי ירי של סוגים אחרים של תאי עצב, לעומת זאת, afferents רבות נותקו מהנוירונים שיוצרים אותם. עם זאת, זה עשוי להיות אפשרי בהכנות פרוסה מסוימות להתבונן פלסטיות של תת GQ GPCR אחר astrocytic. לדוגמא, פרוסות יכולים להיות מוכנות עם נוירונים בסיס מוח קדמי כולינרגית והתחזיות שלהם להיפוקמפוס בשלמותה. דגירה של הפרוסות האלה בTTX או גבוה K + תשפיע על שיעורי ירי בסיס של נוירונים הכולינרגית, מה שמוביל לקנה מידה של mAchRs בהאסטרוציטים של Oriens שכבה, שמקבלים חלק ניכר מהזנת כולינרגית 1. חלופה שלא נבדק עדיין גישה ללמוד דרוג astrocytic קולטן בתוך אזור מסוים של המוח, עם כל החיבורים ללא פגע בעוד קנה מידה מתרחשת, יכול להיות לשימוש מודל in vivo שבו שחרור מתמשך של TTX מושגת על ידי השתלה של פלסטפולימר ic Elvax 40W מעל האזור של עניין 35. גישה זו כבר השתמשה בעבר במחקר של קנה מידה עצבית, אלא גם צריכה להיות רלוונטי לכיול astrocytic. לבסוף, עם את ההודעה הנכונה, מחקרים עתידיים יכולים לבחון משפחות GPCR אחרות, לרבות שינויים בi GPCRs של G או G. אפשר לחזות GABA-B G astrocytic אני GPCRs להיות מושפע בעקבות העיכוב של ירי באופן מקומי מקרין interneurons GABA בתוך כל הכנת פרוסה. פיתוח המדדים חדשים מיקוד מולקולות איתות אחרות, כגון מחוון של מחנה השליח השני בזמן אמת, הייתי לפתוח את האזור חדש של מחקר על תקשורת קולטן תא העצב לastrocyte.
קנה מידה דו כיוונית של mGluRs astrocytic ידי מניפולציה של שיעורי ירי נוירון בסיסיים מספקת מידה מסוימת של הרגישות של האסטרוציטים לשחרורו בתיווך-AP של הנוירוטרנסמיטר. האסטרוציטים, ככל הנראה, יכולים לחוש APS וglutama ספונטנייםשחרור te בסינפסות של תאי הפירמידה שפר טחונות-CA1 גם כאשר תאי K + הוא בטווח פיסיולוגי. בעוד יישום חריף של TTX אינו מפחית את התדירות של astrocyte הספונטני Ca 2 + פעילות 18, 36, 37, Ca 2 + הפעילות בין האסטרוציטים באוכלוסייה הופך להיות חסרת קורלציה 36, מתן עדות לכך שקולטני astrocytic גלאי סוכנות הידיעות AP. הדבר מצביע על כך האסטרוציטים לחוש בנקודות עצביות ספונטניות ללא השפעה על Ca 2 + הפעילות הכוללת שלהם. מקובל כי ריכוזים תאיים של ה-IP 3 צריכים להגיע לרמת סף כדי לעורר IP 3 רופי מספיק כדי להוביל לCa 2 + גובה לזיהוי. אפשר בנקודות עצביות ספונטניות להפעיל GPCRs astrocytic מבלי לייצר 2 + גבהים Ca מדידים? מחקרים עתידיים יכולים לנצל פלואורסצנטי התהודה העברת אנרגיה (סריג) או techn דומה ique (כמו ברט) כדי לבחון את מערכת היחסים בין צימוד חלבון G לקולטן (מדד של הפעלת קולטן) וCa 2 + שחרור מחנויות פנימיות. ברט כבר נעשה שימוש נרחב במבחנה כדי לזהות צימוד החלבון לGPCR G 38, למרות שזה עשוי להיות קצת זמן לפני שטכנולוגיה זו תהיה זמינה לשימוש בהכנות רקמות שלמות. יתכן כי GPCRs GQ astrocytic נמצאים מופעלת לעתים תכופות יותר מאשר ניתן להקליט באמצעות הכלים Ca 2 + הדמיה הזמינות כרגע. בנוסף לחישת פוטנציאל פעולה, GPCRs GQ astrocytic יכולה להיות גם מסוגלת לזהות שחרור quantal מיניאטורי של הנוירוטרנסמיטר כפי שדווח במחקר שנערך לאחרונה 39. השיטה דרוג כיוונית המתוארת כאן עשויה לשמש במחקרים עתידיים על מנת לספק מדד למידה שבה GPCRs astrocytic GQ לזהות שחרור quantal ועי של הנוירוטרנסמיטר, על ידי הכללת bafilomycin A1 בפרוטוקול הדגירה המידה.
ntent "> עד כה, פרוטוקולי קנה המידה היה בשימוש רק בפרוסות בהיפוקמפוס מעכברים לנוער (p12-p18). לכן, אינה ידוע כרגע אם דרוג קולט astrocytic יכול גם להיגרם ברקמה שהתקבלה בעכברים בוגרים. מחקר שנערך לאחרונה משכנע עולה כי קבוצת ביטוי אני mGluR בהאסטרוציטים פוחת במידה ניכרת לאחר השבוע של גיל הראשון וממשיך לרדת עד לבגרות, עם רמות נמוכות מאוד של ביטוי הקולטן בהאסטרוציטים מבוגרים 40. לפיכך יהיה מעניין לקבוע אם mGluRs astrocytic בהיקף של עד הבא ארוך עיכוב ארוך של ירי עצבי בפרוסות בהיפוקמפוס העכבר בוגרות לרמות מתקרבות לאלה ראו בהאסטרוציטים מעכברים לנוער. ממצא זה מציע כי ביטוי הקולטן astrocytic אינו סטטי בגיל מסוים, אך יכול להשתנות במהירות בהתאם לרמות של פעילות עצבית. בניגוד ל ביטוי מופחת של הקבוצה אני mGluRs בעכברים בוגרים, ראיות מתגלה כי רצפטורים adrenergic, כוללים & #945; 1A, 2A α, וβ 1 תת, באים לידי ביטוי בעיקר על ידי האסטרוציטים במוח הבוגר 3, 4. Adrenergic 1A α GQ GPCR עשוי להיות יעד אטרקטיבי למחקרים עתידיים של תקשורת נוירון לastrocyte, לרבות אם קולטנים אלה רגישים לשינויים בשיעורי ירי נוירון adrenergic.The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להכיר המרכז של UC Riverside לגלייה-עצבי אינטראקציות לדיון חשוב של פרוטוקולי קנה המידה ונתונים. המחברים רוצים גם לתת תודה כנה לך Abcam למתן חסות לפרסום של עבודתם.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |