Hier beschrijven we een aanpassing van de protocollen voor homeostatische plasticiteit induceren in neuronen voor de studie van plasticiteit van astrocytaire G-proteïne gekoppelde receptoren. Onlangs gebruikt om wijzigingen in astrocytaire I mGluRs bij jonge muizen te onderzoeken, kan de werkwijze worden toegepast voor de schaal van verschillende astrocytaire GPCRs meten in weefsel van volwassen muizen in situ en in vivo, en een betere waardering van de gevoeligheid van astrocytaire receptoren krijgen veranderingen in neuronale activiteit.
Bijna twee decennia van onderzoek heeft aangetoond dat astrocyten in situ en in vivo te uiten tal van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) die kunnen worden gestimuleerd door neuronaal uitgebracht zender. Echter, het vermogen van astrocytaire receptoren plasticiteit vertonen in reactie op veranderingen in neuronale activiteit weinig aandacht gekregen. Hier beschrijven we een model dat kan worden gebruikt om globaal opschalen of omlaag astrocytaire I metabotrope glutamaatreceptoren (mGluRs) bij acute hersencoupes. Inbegrepen zijn methodes over hoe te bereiden parasagittal hippocampale plakken, bouwen kamers geschikt voor slice langdurige incubatie, bidirectioneel manipuleren neuronale actiepotentiaal frequentie, belasting astrocyten en astrocyten processen met fluorescerende Ca 2 +-indicator, en veranderingen in astrocytaire Gq GPCR-activiteit door opname te meten spontane en uitgelokte astrocyten Ca 2 + evenementen met behulp van confocale microscopie. In wezen, een "calcium roadmap "is bedoeld voor informatie over plasticiteit van astrocytaire Gq GPCR's te meten. Toepassingen van de techniek voor de studie van astrocyten worden besproken. Het hebben van een goed begrip van hoe astrocytaire receptor signalering wordt beïnvloed door veranderingen in neuronale activiteit heeft belangrijke implicaties voor zowel de normale synaptische functie, alsook processen onderliggende neurologische aandoeningen en neurodegeneratieve ziekten.
Astrocyten reageren binnen enkele seconden op stimulatie van neuronen of neuronale axonen met stijgingen van cytoplasmatische Ca 2 + bijna uitsluitend als gevolg van de activering van astrocytaire Gq GPCR's. Bijvoorbeeld, muscarine acetylcholine receptoren 1, cannabinoidreceptoren 2, α 1A adrenergische receptoren 3, 4, en groep I mGluR's (zie hieronder) zijn astrocytaire Gq GPCR subtypen acuut reageren neuronale activiteit. Activering van astrocytaire groep I mGluR's is het meest uitgebreid aangetoond na stimulatie van neuronale glutamaat afferenten in situ (zoals acute hippocampale plakken) 5-7, en bij volwassen muizen cortex in vivo na sensorische stimulatie 8. Het resultaat van de activering van astrocytaire Gq GPCR signalering op de biologie en fysiologie van astrocyten, neuronen, of astrocyten-neuron interacties heeft een kwestie van debat 9-12 geweest. Het zal s zijnome tijd voordat de functie van neuron-to-astrocyten receptor signalering wordt volledig gewaardeerd.
Hoewel het duidelijk is dat neuronen astrocytaire receptoren kunnen activeren met experimentele protocollen er aspecten van neuron naar astrocyten receptor communicatie die blijven slecht begrepen. Ten eerste, het werkelijke bedrag van de neuronale activiteit die nodig is om astrocytaire Gq GPCR te activeren is niet goed gedefinieerd, en ten tweede, is het vermogen van astrocytaire receptoren gebruik-afhankelijke plasticiteit vertonen weinig aandacht gekregen. Om te beginnen om deze vragen te beantwoorden, hebben we onlangs een protocol ontwikkeld om bidirectionele schaling van astrocytaire groep I mGluRs in acute juveniele hippocampus plakjes induceren in respons op lange termijn veranderingen in neuronale actiepotentiaal (AP) synaptische activiteit. Vergelijkbaar met wat is ontdekt voor bidirectionele homeostatische plasticiteit van neuronale ionotrope glutamaatreceptoren 13, 14, astrocytische I mGluRs opschalen following blokkade van neuronale actiepotentialen en afbouwen wanneer neuronale actiepotentiaal frequentie wordt verhoogd 15. De compenserende veranderingen in astrocytaire receptoren worden gemeten door spontane en uitgelokte astrocyte Ca2 + transiënten en vergelijken van de eigenschappen van deze gebeurtenissen die van astrocyten in controle omstandigheden. In dit manuscript beschrijven we de volledige methodologie voor het gebruik van dit protocol, inclusief de voorbereiding van acute plakjes van de hippocampus, incubatie-omstandigheden te astrocyten receptor scaling induceren, astrocyten Ca 2 +-indicator kleurstof laden, Ca 2 + imaging technieken met behulp van confocale microscopie, en de verwachte effecten op astrocyten Gq GPCR-activiteit. Voorspelbaar effect op astrocyten Ca 2 + signaaloverdrachtseigenschappen – die overeenkomen met de eerder in gekweekte cellen getransfecteerd met verschillende expressie niveaus van Gq GPCRs – een "routekaart" die kunnen worden gebruikt in toekomstige studies te testen op veranderingen alstrocytic GPCR expressie. De vertakkingen en potentiële toepassingen voor het gebruik van deze techniek zal bijdragen tot het begrijpen van de astrocyt-neuronale interacties in gezonde en zieke hersenen.
De beschreven schaalvergroting modellen vertegenwoordigen praktische methoden voor het onderzoeken van de lange termijn plasticiteit van astrocytaire groep I mGluRs. Imaging spontane en uitgelokte Ca2 + gebeurtenissen verschaft een gevoelige test voor het meten van veranderingen in astrocytaire Gq GPCR-activiteit, zoals duidelijk bewijs is vastgesteld dat astrocyten Ca2 + verhoging optreden bij ontslag uit IP 3R-gevoelige winkels stroomafwaarts van Gq GPCR activering 10, 12, 17, 18. Het percentage van astrocyten in de bevolking reageert op groep I mGluR agonist en het patroon van dergelijke Ca 2 + reacties rapporteren veranderingen in groep I mGluRs door astrocyten.
De specifieke techniek die gebruikt astrocyten geladen met Ca 2 +-indicator is een belangrijke overweging bij het ontwerpen van experimenten om te zoeken naar veranderingen in astrocytaire Gq GPCR-activiteit. Bolus-laden of bulk laden meerdere astrocyten, of patch-clamp laden van individuele astrocyten kunnen worden gebruikt om beelden Ca2 + transiënten in astrocyten. Elke benadering heeft bepaalde voordelen en nadelen. Direct vullen astrocyten met Ca 2 +-indicator via patch clamp maakt eenduidige identificatie van de cel als een astrocyten zonder behoefte aan een secundaire marker zoals SR-101. Patch-clamp levering indicator maakt ook opname van Ca2 +-activiteit van kleine astrocytaire compartimenten inclusief Borstelig fijne processen mogelijk dieper in het segment waar de cellen gezonder en met meer intacte interacties met synapsen (afhankelijk van het laservermogen beschikbaar). Echter, patch-clamp laden kampen met een lage doorvoersnelheid als gegevens worden verzameld een cel tegelijk. Bulk-laden, daarentegen kan een groot aantal astrocyten worden geladen met Ca2 + indicator gelijktijdig afgebeeld. Slechts astrocyten nabij het oppervlak (<20 urn) van het segment zijn geladen, met bijbehorende bezorgdheids over gezondheid cel en intact synapsen.
De tegendruk bolus-loading protocol hier gepresenteerde biedt een middenweg, met relatief hoge capaciteit en het vermogen om Ca2 + te monitoren dieper in de plak (40-75 urn). Een aanzienlijke toename van het percentage spontaan actieve astrocyten met de bolus-loading techniek waargenomen vergeleken met bulk-loading, suggereert dat de verbindingen tussen neuronen synapsen en astrocytaire processen vollediger 15. Met goede lading, kan men vaak controleren Ca 2 + activiteit hoofdprocessen van astrocyten (gegevens niet getoond) of kan zelfs kleinere compartimenten met 2-foton microscopie. Echter, zorg zou moeten worden uitgeoefend in het toewijzen van de kleinere processen om een bepaalde astrocyten, zoals de grenzen opgaan in de niet-specifieke achtergrond kleuring. Een bijkomend probleem bij het gebruik van bulk-laden of bolus-laadprocedures is de behoefte aan een tweede marker voor astrocyten identificatie. Hoewel het is vele jaren bekend dat astrocyten duren voorkeur van AM ester Ca2 + indicatoren wordt de tweede marker SR-101 vaak gebruikt om het geladen cellen zoals astrocyten verifiëren. SR-101 kan op zichzelf veranderen de intrinsieke prikkelbaarheid van neuronen 29. Gebruik van SR-101 bevestigt de noodzaak alle astrocyten Ca2 + metingen in TTX mogelijke SR-101 effecten op neuronale exciteerbaarheid beperken. Aangenomen dat zowel controle en experimentele groepen omvatten SR-101, moet de marker op zichzelf geen rekening met de effecten waargenomen in astrocyten Ca2 +-signalen na langdurige manipulatie van neuronale actiepotentialen. SR-101 kan meer een zorg in hoge K + experimenten, maar omdat het verschil tussen 2,5 mM K + vs verminderen 5,0 mM K + als het basale vuursnelheid niet proportioneel gewijzigd.
Een veelbelovende aanpak van Ca 2 + leveren </sup> Indicator astrocyten onlangs ontstaan die een aantrekkelijk alternatief biedt voor de meer traditionele benaderingen met Ca2 + kleurstoffen. Grote vooruitgang is geboekt in de afgelopen jaren met genetisch gecodeerd calcium indicatoren (GECIS) gericht op astrocyten 30-32. GECIS kan tot astrocyten worden geleverd door in vivo micro-injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren in een gebied van de hersenen van belang, zoals de hippocampus. Expressie van GECIS wordt bereikt na ongeveer twee weken na virale infectie 32. Er zijn vele voordelen zijn aan het gebruik van GECIS in astrocyten. Eerst worden de vectoren gericht op astrocyten met een astrocyt-specifieke promoter, zodat de gelabelde cellen astrocyten 32. Ten tweede, de ruis signaal-lijkt nu vergelijkbaar met wat kan worden verkregen met behulp van patch-clamp levering van kleurstof, maar zonder het invasieve karakter van een patch pipet op de cel 32 hebben gehad. Ten derde kan de indicatoren delivered en uitgedrukt in volwassen weefsel, wat problematisch is met behulp van bulk-loading levering methoden. Verder is de uitdrukking is mozaïek, het aanbieden van de mogelijkheid om onderscheid te maken tussen meerdere astrocyten. Aldus verschillende astrocyten kan mogelijk worden tegelijk afgebeeld, terwijl ook het opnemen in de soma en fijne vertakkingen op hetzelfde moment. Daarom zou kunnen een enkele techniek worden gebruikt in plaats van drie afzonderlijke technieken (bulk-loading, bolus-laden, en patch-clamp lading) te schalen activiteit van astrocytaire Gq GPCRs opnemen, aanzienlijke verhoging van efficiëntie.
Een potentieel nadeel van het gebruik van virale-gemedieerde levering van Ca 2 +-indicatoren om astrocyten is het mogelijk effect op de gezondheid slice 32. De adeno-geassocieerde virale vectoren gebruikt om de GECIS leveren zijn eerder aangetoond reactieve gliosis van astrocyten 33 veroorzaken. Voorbereiding van de hersenen plakjes in het algemeen waarschijnlijk initieert vroege stadia van de pathologie waaronder release van inflammatory moleculen 10. Daarom gecombineerd met lange incubatietijden vereist schaling van astrocytaire receptoren induceren, gebruik van GECIS geleverd met behulp van virale vectoren zouden moeten extra aandacht krijgen in de context van segment gezondheid in dit soort experimenten.
Bij toepassing van dit protocol is het belangrijk om in gedachten te houden dat de inwerktijd voor agonist een respons zal variëren als een functie van de beschikbaarheid receptor. Voor een bepaalde concentratie van agonist, zal de verwerkingstijd te langer als receptoren verkleind en korter als receptoren opgeschaald voor het geneesmiddel voldoende concentratie te bereiken in het weefsel voldoende receptoren activeren om een Ca 2 + produceren respons. Daarom kunnen geneesmiddelen verwerkingstijden en eventueel de concentratie moeten worden aangepast afhankelijk van de beoogde richting van de schaal. Zo moet de agonist concentratie worden verlaagd in de case van TTX om te voorkomen dat het verzadigen van de reacties, en de toegenomen na incubatie plakjes in een hoge K + tot zelfs een reactie. Specifiek werd de DHPG concentratie verschoven van 5-15 uM TTX na behandeling met 30-50 pM na 5,0 mM K + behandeling teneinde Ca2 + reactiepatronen bestuderen, zoals 5-15 uM vaak te laag om betrouwbare reacties produceren astrocyten na afbouw van groep I mGluRs.
Opname van Ca 2 + astrocyten activiteit geeft geen direct bewijs van receptor internalisatie of insertie van of naar de plasmamembraan. Op basis van de opmerkelijke gelijkenis van de gegevens met die van eerdere studies in vitro waarin de directe relatie tussen Gq GPCR expressieniveaus en spontane onderzocht en uitgelokte Ca2 + transiënten 21-24, het meest logische interpretatie van de wijzigingen in Ca 2 + signalering dat de astrocyt oppervlak receptor expressie niveausgewijzigd. Een complementaire aanpak kan een belangrijke overweging zijn als men wil om aanvullend bewijs te verstrekken over de plaats van het effect op de Ca 2 +-activiteit. Een strategie die wij gebruikten was het effect van TTX incubatie op hippocampale plakken van astrocytaire MrgA1R muizen onderzocht. Deze transgene muizen brengen een buitenlandse Gq GPCR (het MrgA1R) alleen in astrocyten. Omdat deze receptor is niet afkomstig van de hersenen, is er geen endogene neurotransmitter aanwezig om zijn activiteit te veranderen. Vorige werk gesuggereerd dat deze receptor aangrijpt dezelfde intracellulaire signaalmoleculen als endogene groep I mGluRs in dezelfde astrocyten 34. Na langdurige incubatie van segmenten van MrgA1R muizen in TTX geen verschillen in-agonist opgewekte MrgA1R responsen in vergelijking met hetzelfde nest controle geïncubeerd segmenten zou aantonen dat het effect van astrocyt Ca2 + activiteit door veranderingen gelokaliseerd aan de oppervlakte receptor, vooral als groep I mGluR reacties zijn nog steeds significantly versterkt dezelfde astrocyten. Een alternatief, hoewel misschien meer betrokken strategie zou zijn om astrocyten isoleren van de plakken voor Western blot-analyse, zolang een membraanfractie kan worden geanalyseerd op veranderingen in de oppervlakte receptor expressieniveaus. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of flowcytometrie kan hier nuttig zijn.
De mogelijke toepassingen van deze techniek voor de studie van neuronen, astrocyten en astrocyt-neuronale interacties velen. In onze experimenten alleen DHPG opgewekte groep I mGluR astrocytaire Ca2 + responsen werden bestudeerd in geïsoleerde acute hippocampale plakken van jonge muizen. Dit preparaat heeft niet alleen intacte afferenten (Schaffer collateralen), maar ook neuronen die leiden tot hun (CA3 pyramidale cellen), waardoor aan het afvuren tarieven van deze glutamaterge neuronen manipuleren op de postsynaptische cellen (CA1 pyramidale cellen) en de astrocyten in stratum radiatum wiens processen geassoe met deze synapsen. De acute hippocampus slice niet de beste voorbereiding voor het manipuleren afvuren bekijken van andere soorten neuronen echter zoveel afferente vezels worden gescheiden van de neuronen die leiden tot hen. Toch kan het mogelijk in bepaalde slice preparaat plasticiteit andere astrocytaire Gq GPCR subtypen zien. Bijvoorbeeld zou segmenten worden bereid met basale voorhersenen cholinerge neuronen en hun uitsteeksels intact hippocampus. Incubatie van deze segmenten in TTX of verhoogde K + zou beïnvloeden basale werkingsveld van cholinerge neuronen, waardoor schaling van mAchRs in astrocyten stratum Oriens, die een aanzienlijk deel van de cholinerge ingang 1 ontvangen. Een alternatieve benadering nog niet geteste studeren astrocytaire receptor schaal binnen een bepaald gebied van de hersenen, met alle verbindingen intact terwijl schaalvergroting optreedt, kan een in vivo model waarbij een vertraagde afgifte van TTX wordt verkregen door implantatie van een plast gebruikenic polymeer Elvax 40W boven de regio van belang 35. Deze benadering is eerder gebruikt in een studie van neuronale schalen maar ook voor astrocytaire schaling. Tot slot, met de juiste uitlezing, toekomstige studies zouden andere GPCR families, waaronder veranderingen in G s of G i GPCR's te onderzoeken. Men zou astrocytaire GABA B G voorspellen i GPCR's worden beïnvloed volgende remming van de vuren in lokaal projecteren GABA interneuronen binnen een slice voorbereiding. Ontwikkeling van nieuwe indicatoren richten andere signaalmoleculen, zoals een real-time indicator van de second messenger cAMP, zou opent een heel nieuw gebied van onderzoek naar neuron-to-astrocyten receptor communicatie.
Bidirectionele schaling van astrocytaire mGluRs door manipulatie van basale neuron vuren tarieven biedt een maatstaf voor de gevoeligheid van astrocyten om AP-gemedieerde afgifte van neurotransmitter. Astrocyten kan blijkbaar voelen spontane AP's en glutamate vrijkomen ten Schaffer onderpand-CA1 pyramidale cel synapsen zelfs wanneer extracellulaire K + is binnen een fysiologische bereik. Terwijl acute toepassing van TTX niet de frequentie van spontane astrocyten Ca 2 +-activiteit 18, 36, 37, de Ca2 + activiteit onder de astrocyten in de populatie wordt gedecorreleerde 36, waarin wordt aangetoond dat astrocytaire receptoren AP detectoren verminderen. Dit suggereert dat astrocyten voelen spontane neuronale AP's zonder invloed op hun algemene Ca 2 +-activiteit. Het is algemeen aanvaard dat de intracellulaire concentraties van IP-3 moet een drempelwaarde om IP 3 Rs voldoende stimuleren om tot een detecteerbare Ca 2 + hoogte bereiken. Kan spontane neuronale AP activeren astrocytaire GPCR's zonder dat meetbare Ca 2 + verhogingen? Toekomstige studies zouden Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) of een soortgelijke techn gebruiken ique (zoals BRET) de verhouding tussen G-eiwit koppelen aan de receptor (een maat voor receptor activatie) en Ca2 + afgifte uit interne opslag te onderzoeken. BRET is uitgebreid gebruikt in vitro G-eiwit naar GPCR koppeling 38 detecteren, hoewel het enige tijd kan duren voordat deze technologie beschikbaar voor gebruik in intact weefsel preparaten. Het is mogelijk dat astrocytaire Gq GPCRs worden geactiveerd veel vaker dan kan worden opgenomen met de momenteel beschikbare Ca 2 + imaging-tools. Naast sensing actiepotentialen, kan astrocytaire Gq GPCRs ook kunnen miniatuur quantale afgifte van neurotransmitter detecteren zoals gerapporteerd in een recente studie 39. De bidirectionele schaling hier beschreven methode kan worden gebruikt in toekomstige studies een maat voor de mate waarin astrocytaire Gq GPCRs detecteren quantale vesiculaire afgifte van neurotransmitter, door het opnemen van bafilomycine A1 incubatie protocol verschaffen.
ntent "> Tot dusverre de schaal protocollen slechts bij hippocampale plakken aan juveniele muizen (p12-p18). Daarom is nog onbekend of astrocytaire receptor schaalverdeling kan ook worden geïnduceerd in weefsel verkregen uit volwassen muizen. Een boeiende recente studie stelt I mGluR expressie in astrocyten vermindert aanzienlijk na de eerste week en blijft dalen tot volwassenheid, met zeer lage niveaus van receptor expressie in volwassen astrocyten 40. Het zou dan ook interessant zijn om te bepalen of astrocytaire mGluRs opschalen na lange remming van de neuronale in volwassen muis hippocampus plakjes tot vrijwel die gezien in astrocyten van juveniele muizen termijn. Deze bevinding suggereert dat astrocytaire receptor expressie is niet statisch op een bepaalde leeftijd, maar kan snel veranderen, afhankelijk van niveaus van neuronale activiteit. In tegenstelling tot verminderde expressie van groep I mGluRs in volwassen muizen, is het bewijs in opkomst dat adrenerge receptoren, met inbegrip van & #945, 1A, 2A α en β 1 subtypes, worden voornamelijk uitgedrukt door astrocyten in de volwassen hersenen 3, 4. De α 1A adrenergische Gq GPCR kan een aantrekkelijk doelwit voor toekomstige studies neuron naar astrocyten communicatie, inclusief of deze receptoren zijn gevoelig voor adrenerge neuronen vuren tarieven.The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag UC Riverside Center for Gliale-neuronale interacties voor waardevolle discussie over de schaalvergroting protocollen en data te erkennen. De auteurs willen ook graag een oprecht bedankje geven aan Abcam voor het sponsoren van de publicatie van hun werk.
Chamber Supplies | |||
Brinkmann pipette storage container | Fisher Scientific | 03-491 | Use the drawer portion as the incubation chamber |
Electrical drill | |||
Flexible tubing | Tygon | R-3603 | |
Silicone seam sealant | Also called aquarium seam sealer | ||
Gas tank | 95% oxygen, 5% carbon dioxide | ||
Natural beveled pipette tip | USA Scientific | 1111-1000 | Cut-to-fit to connect oxygenate lines |
One-to-six lines manifold | Warner Instruments | 64-0210 (MP-6) | For the microloader-manifold apparatus |
Eppendorf microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit |
Floating Bubble Rack | Bel Art Scienceware | F18875-0400 | For slice holder |
600 micron Sefar Nitex nylon mesh | ELKO filtering Co. | 06-600/51 | For slice holder |
Krazy Glue | For slice holder | ||
Reagent | |||
Isoflurane | Baxter | 1001936060 | |
NaCl | Fisher | S271-3 | |
KCl | Fisher | P333-500 | |
CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
MgCl2 | Fisher | M33-500 | |
NaH2PO4 | Fisher | S369-500 | |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 | |
Glucose | Fisher | Fisher | |
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Acros Organics | 53188-07-1 | |
Ascorbic acid | Acros Organics | 401471000 | |
Tetrodotoxin citrate (TTX) | Ascent Scientific | Asc-055 | |
Sulforhodamine 101 (SR-101) | Sigma-Aldrich | 284912 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Pluronic Acid F-127 | Invitrogen, Molecular Probes | P6867 | |
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging) | Invitrogen, Molecular Probes | O6807 | |
(RS)-3,5-DHPG | Ascent | Asc-020 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | |
Carbamoylcholine chloride (Carbachol) | Sigma-Aldrich | C4382 | |
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP) | Sigma-Aldrich | A7699 | |
Dissection Tools | |||
Single-edge razor blade | GEM | 62-0161 | For bisection |
Double edge razor blade | TED PELLA, INC. | 121-6 | For cutting slices |
Mayo Scissors, supercut | WPI | 14010-15 | For decapitation |
Fine iris scissors, straight | Fine Science Tools | 14094-11 | For cutting the skull |
Iris forceps, curved | WPI | 15915 | To remove the skin and skull |
Small spatula | To remove/transfer the brain | ||
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | For hippocampus dissection |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20B | For transferring brain slices |
Pasteur pipette rubber bulb | Fisher | 03-448-22 | For transferring brain slices |
Polystyrene 100-mm tissue culture dishes | Corning | 25020 | |
Equipment | |||
Vibratome | Leica | VT 1200S | |
Water bath | Fisher | ISOTEMP 210 | For warm incubation |
Micropipette puller | Narishige | PC-10 | For bolus-loading pipette |
Confocal microscope | Olympus | Olympus Fluoview 1000 | |
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform | Warner Instruments | RC-26GLP | diamond bath with low profile |
Borosilicate glass pipette | World Precision Instruments | TW150F-4 | For bolus-loading pipette |
Micromanipulator | Sutter instrument | ROE-200 | For bolus-loading pipette |
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate | Costar | 8161 |