Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial<em> In Vivo</em
Summary
GABAérgica inibição pré-sináptica é um poderoso mecanismo de inibição na espinal medula importante para o motor e a integração do sinal sensorial em redes da medula espinal. Subjacente despolarização aferente primário pode ser medido por registo dos potenciais de raiz dorsal (DRP). Aqui demonstramos um método in vivo de gravação de DRP em ratinhos.
Abstract
A inibição pré-sináptica é um dos mais poderosos mecanismos de inibição na espinal medula. O mecanismo fisiológico subjacente é uma despolarização das fibras aferentes primários mediadas por GABAergic sinapses axo-axonal (despolarização aferente primário). A força de despolarização aferente primário pode ser medido por registo dos potenciais conduzida de volume na raiz dorsal (potenciais de raiz dorsal, DRP). As alterações patológicas de inibição pré-sináptica são cruciais para o processamento central anormal de determinadas condições de dor e em alguns transtornos de hiperexcitabilidade motor. Aqui, descrevemos um método de gravação DRP in vivo em camundongos. A preparação das raízes dorsais da medula espinhal do animal anestesiado eo procedimento de gravação usando eletrodos de sucção são explicados. Este método permite medir GABAergic DRP e, assim, estimar a inibição pré-sináptica da medula em ratos vivos. Em combinação com os modelos de camundongos transgênicos, a gravação DRP pode serve como uma ferramenta poderosa para investigar associada à doença da coluna vertebral fisiopatologia. In vivo gravação tem várias vantagens em relação ao ex vivo preparações medulares isoladas, por exemplo, a possibilidade de gravação ou manipulação de redes supra-e indução de DRP por estimulação de nervos periféricos simultâneos.
Introduction
A inibição pré-sináptica é um dos mais poderosos mecanismos de inibição na espinal medula. Inibe potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSPS) em motoneurónios monosynaptically excitado sem alterar o potencial da membrana pós-sináptica e a excitabilidade de neurónios motores 1-3. Despolarização aferente primário (PAD) induzida por GABAergic sinapses axo-axonal em fibras pré-sinápticas sensoriais é o mecanismo subjacente 4-7 (ver também Figura 1A). Essas sinapses contêm GABA A e GABA-B (receptores GABA A e GABA B R R). A actividade do GABA R conduz a um aumento da condutância de cloreto que provoca PAD, devido à distribuição de iões local. Esta despolarização bloqueia a propagação dos potenciais de ação nos terminais do axônio e reduz a sua força levando a uma diminuição da Ca 2 +-influxo e uma redução da liberação do transmissor. A ativação dos receptores GABA B não fazt contribuir para PAD, mas leva a uma redução de Ca 2 +-influxo reforçando assim a inibição pré-sináptica. Enquanto a activação de receptores GABA A R parece estar envolvido na inibição de curto prazo, o GABA B R estão envolvidos na modulação de longo prazo de 8-10. Além de GABA, que representa a maior parte do PAD e inibição pré-sináptica, outros sistemas transmissores também pode modular e contribuir para este mecanismo 11,12.
As alterações patológicas na inibição pré-sináptica parece ser crucial em vários estados de doença, por exemplo, inflamação e dor neuropática periférica 13,14, bem como anormal processamento da dor central 15, lesão medular 16, e doença do SNC com hiperexcitabilidade motora mediada pela transmissão gabaérgica defeituoso 17, 18. Assim, a estimativa inibição pré-sináptica a pena investigar patologias experimentais no nível da medula espinhal in vivo </em>. PAD dá origem a volumes conduzidos potenciais fornecem uma medida directa da inibição pré-sináptica na medula espinal. Esses potenciais são chamados potenciais de raiz dorsal (DRP) e pode ser medido a partir de raízes dorsal da coluna vertebral após a estimulação das raízes dorsais adjacentes 7.
As primeiras medidas de DRP foram relatados em gatos e sapos 19 e foram intensamente estudado em gatos por Eccles, Schmidt, e outros no início dos anos 1970 3,4,20,21. Enquanto in vivo gravações de DRP em gatos 22 e 23 ratos foram amplamente usadas, as medidas em ratinhos foram realizados quase exclusivamente em preparações isoladas ex vivo da medula espinhal 15,24. Aqui, descrevemos um método para gravar DRP em ratos anestesiados in vivo, permitindo uma medida direta da inibição pré-sináptica no organismo intacto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Registros eletrofisiológicos extra e intracelulares de atividade neuronal e potenciais sinápticos in vivo são o estado da arte das técnicas de investigação de funções neuronais do sistema nervoso central e fisiopatologia. Spinal integração é fundamental para o funcionamento do motor, por exemplo, os movimentos dos membros e para a percepção sensorial multimodal. Inibição pré-sináptica é um mecanismo fundamental neste processo computacional garantindo respostas adequadas aos estímulos…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Manfred Heckmann para discussões úteis durante o estabelecimento do método. Além disso, agradecemos a Claudia Sommer para assistência técnica e Frank Schubert para o apoio a produção do vídeo. O trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF), na Alemanha, FKZ: 01EO1002 e do Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF) do Hospital Universitário de Jena.
Materials
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| (Melsungen, Germany) | |||
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamin 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30G micro needle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| (Melsungen, Geramny) | |||
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| Stimulator | |||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Data acquisition | |||
| Universal amplifier | npi (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
Riferimenti
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