После перерезки спинного, взрослые данио имеют функциональное восстановление по шести недель после травмы. Для того чтобы воспользоваться личиночной прозрачности и ускорения восстановления, мы представляем метод для пересекающих личинок спинной мозг. После перерезки, мы наблюдаем сенсорную восстановление начиная с 2-х дней после травмы, и С-образный изгиб движение на 3 дня после травмы.
Млекопитающие неудачу в сенсорной и моторной восстановления следующие повреждения спинного мозга из-за нехватки аксонов отрастания ниже уровня травмы, а также неспособности возобновить спинного нейрогенез. Однако некоторые anamniotes в том числе данио рерио Danio демонстрируют оба сенсорной и функциональное восстановление даже после полной перерезки спинного мозга. Взрослый данио является признанным модельный организм для изучения регенерации следующие повреждения спинного мозга, с сенсорной и моторной восстановления по 6 недель после травмы. Для того чтобы воспользоваться анализа в естественных условиях регенеративного процесса доступный в прозрачном личинок рыбок данио, а также генетические инструменты не доступны во взрослом, мы используем личиночной данио для изучения регенерации после перерезки спинного мозга. Здесь мы показываем, метод воспроизводства и проверяемым, пересекающих личинок спинной мозг. После перерезки, наши данные показывают, начало сенсорная восстановления на 2 дня после травмы (руб), остроумиеч С-изгиб движение обнаруживается на 3 руб и возобновления свободное плавание на 5 руб. Таким образом мы предлагаем личиночной данио в качестве компаньона инструмент в взрослых данио для изучения восстановления после травмы спинного мозга.
Основные травмы спинного мозга человека часто приводит к постоянному параличу и потере чувствительности ниже уровня травмы, в связи с невозможностью вырастить аксоны или возобновить нейрогенез 1,2. В отличие от млекопитающих, однако, anamniotes включая саламандры и рыбок данио (Danio рерио) показать уверенное восстановление даже после полной перерезки спинного мозга 3,4.
Взрослый данио является устоявшейся моделью для изучения процесса восстановления следующем повреждением спинного мозга 5-7. После полной перерезки спинного мозга, восстановление сенсорной и локомотивного функции наблюдается в взрослых данио на 6 недель после травмы 8. Для того чтобы исследовать процесс регенерации в естественных условиях, мы обратились к прозрачной личиночной данио 9.
Здесь мы представляем метод разреза спинного мозга из 5 дней после оплодотворения (DPF) личиночной данио USIнг скошенную микроинъекции пипетки как скальпелем, модифицированный из Бхатт, и др.. 10 Этот метод поддерживает высокую пропускную способность, низкий смертности, и воспроизводимость. С практикой, 300 личинок / ч может быть перерезана, и свыше 6 месяцев transections, в том числе более 3600 животных, 98.75% ± 0,72% дожили до 7 дней после травмы (точек на дюйм). Наши данные показывают, быстрое восстановление сенсорной и передвижения, а также: на 1 руб, все движения потерпевшей рыбы движет только грудного плавника передвижения. Тем не менее, личинки начинают реагировать на вольфрамовой иглы сенсорный каудальнее перерезки на 2 руб, восстановить С-изгиба движение на 3 руб, а также отображать хищный плавание на 5 руб 11. Использование окрашивание антител против ацетилированного тубулина, мы подтвердили, что аксоны отсутствуют в месте повреждения на 1 руб, но пересекли место повреждения на 5 руб. Мы считаем, что это протокол предоставит ценную технику для изучения аксонов отрастания и нейрогенеза в спинном мозге после травмы. </p>
При первоначальном изучении этой техники, мы рекомендуем пытаться не более 50-100 transections в течение одной сессии. После освоения этой техники, мы в состоянии секут до 300 эмбрионов в час; Однако этот уровень пропускной требуется несколько месяцев еженедельной практике. Мы также рекомендуем …
The authors have nothing to disclose.
Мы в долгу перед Университета Юты данио объекта для животноводства. RID поддержали NIH R56NS053897, и LKB был predoctoral стажер поддержке инициативы HHMI Мед-В-Град.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
microgrinder | Narishige | EG-44 | |
Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
1ml syringe | BD | 309625 | |
27 ga. needle | BD | 305109 | |
Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
20x E2 (1L) | store at RT | ||
17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
1x E2 (1L) | store at RT | ||
50ml 20x E2 | |||
2ml fresh 500x NaCO3 |