変更された<em>インビトロ</em媒介する癌細胞浸潤におけるホルモン、サイトカインおよび/または成長因子の潜在的な役割を決定するために>浸潤アッセイ
Summary
This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.
Abstract
血清は、癌細胞が微小血管に彼らの血管内を容易に移行し、侵入している方に化学誘引物質として機能します。しかし、細胞が移動した方に実際の分子が、とらえどころのないまま。この修正された浸潤アッセイは、細胞遊走および浸潤を駆動する標的を同定するために開発された。この技術は、特定のホルモン、成長因子、またはサイトカインが癌細胞の浸潤能を媒介する役割を果たしているかどうかを決定するための3つの条件の下で侵入度とを比較する。これらの条件は、ホルモン、成長因子、およびサイトカインおよびiii）CS-FBS +分子（示される「X」）を除去するのi）通常のウシ胎児血清（FBS）、ii）のチャコール処理FBS（CS-FBS）を含む。 FBSと比較して、CS-FBSと細胞浸潤の有意な変化は、変化を媒介するホルモン、サイトカインまたは成長因子の関与を示している。個々の分子は、再度それらの能力をアッセイするためにCS-FBSを追加し直すことができる侵入表現型を詩や救助。さらに、2つ以上の因子は、添加剤または駆動または浸潤を阻害するのに複数の分子の相乗効果を評価するために組み合わせることができる。全体として、この方法は、ホルモン、サイトカイン、および/または成長因子が癌細胞の特定のタイプまたは特定の変異体の化学誘引物質または浸潤の阻害剤として機能することにより、細胞浸潤において役割を果たしているかどうかを決定するために研究者を可能にする。特定の化学誘引物質および阻害剤を同定することによって、この変更された浸潤アッセイは、癌細胞の浸潤を導くシグナル伝達経路を解明するのに役立ち得る。
Introduction
新規な浸潤アッセイは、癌細胞浸潤における化学誘引物質として特定のホルモン、サイトカインおよび/または成長因子の関与を同定することを目的に開発された。細胞外マトリックス（ECM）を通って浸潤する腫瘍細胞の能力は、転移表現型1-3の特徴である。浸潤チャンバーは広範囲の癌細胞の浸潤および遊走を研究するためのin vitroツールとして使用されており、in vivoでの腫瘍浸潤および転移のメカニズムとして知識を提供してもよい。 チャンバは、細胞培養プレートのウェル内にネストされた円筒形の細胞培養インサートから成る。インサートの底部は、規定の孔サイズの半透過性ポリカーボネートまたはポリスチレン膜である。
標準浸潤アッセイでは、細胞は無血清培地でインサートメンブレン上に播種し、血清または血清のような化学誘引物質で充填されている細胞培養ウェルに入れ秒化学誘引力アップら。この力ドライブ細胞を、検出し、細胞数を定量化するために、従来の染料を用いて染色することができる細胞外マトリックス（浸潤）のコーティングを通して、あるいは半透膜（マイグレーション）を介して移動したりする。細胞数は、次に、非侵襲的細胞株における遊走および浸潤の程度に応じて正規化される。この方法では、研究者は、遺伝子操作を含む、種々の条件下で異なる細胞型の浸潤能を評価することを可能にする。
ホルモン、サイトカインおよび成長因子は、血清の重要な構成要素であり、ますます浸潤性の表現型4を駆動すると関連することが示されている。しかし、侵入を媒介するこれらの化学誘引血清分子の性質、役割、および特異性はまだとらえどころのないまま。課題は、血清または血清のような化学誘引物質の特定の要因が運転を担当するかを決定するために残っている癌細胞浸潤ならびにどの分子が侵入プロセスを阻害することができる。本稿では、癌細胞の化学誘引および浸潤を駆動する分子として、ホルモン、サイトカインおよび/または血清中に存在する成長因子の関与の可能性を評価するための方法論を説明します。
この提案された修正されたプロトコルでは、木炭ストリッピングは、2％チャコール処理FBS（CS-FBS）を生成するために、2％ウシ胎児血清（FBS）からホルモン、サイトカインおよび増殖因子を除去するために使用される。 2％FBSおよび2％CS-FBSの両方が癌細胞浸潤を駆動するために化学誘引力を設定するための薬剤として使用される。 FBSは、まず、最も顕著に、ホルモン、サイトカインおよび増殖因子の減少/相対的な非存在下での癌浸潤表現型を研究するための能力を含むいくつかの利点が得られる通常の2％と比較して、化学誘引剤として2％CS-FBSを用いた。また、ホルモン、成長因子の集団を除去するかどうかを評価するために研究者を可能にし、cyのtokinesは侵襲的な指標の増加または減少を引き起こす。アッセイは、その後（ 図2および3を参照）、「X」と称される個々の成分の添加は、減少し、増加を阻害するか、元の値に侵襲的なインデックスを復元することができるかどうかを決定するように設計される。この方法は、木炭ストリッピング時に血清から除去される成分の生理的レベルを達成するために特異的であるが、それはまた、木炭ストリッピングはまた、シグナル伝達経路に影響を与えることができることに留意すべきである。例えば、木炭ストリッピングは、骨前駆細胞のアルカリホスファターゼ活性を低下させ、MAPK活性化剤5の還元により脂肪生成を誘導することが報告されている。チャコール処理メディアは、市販されており、プロトコルに基づくことがデキストランで木炭を結合し、ウシ胎児血清O / N 6と共にインキュベート概説されている。
このアッセイは、RESPOで開発されたNSEはザッカーら 7によって報告された結果に著者は、通常の2％FBSをメディアに向けて移行するときのギャップ結合コミュニケーションに影響を与える変異体の表現型は侵略指数の増加を示したことを実証した。この増加は、チャコール処理血清の置換で除去した。この結果から、著者らは、この変異体は、親油性分子（具体的には、ホルモン、成長因子、またはサイトカイン）7に向かって遊走に影響することを結論付けた。これはよくホルモン、成長因子、サイトカイン、腫瘍促進および浸潤4に関与するシグナル伝達経路を媒介することが知られている。したがって、科学的な研究者がどのような要因（s）が検討され、それらの特定の癌細胞または変異体の腫瘍浸潤を駆動しているかを決定するために重要である。成分の濃度との差に応じて決定されるようなアッセイは、それらの生理学的濃度で、個々の成分の役割に対処するために設計されている＆＃8220; X "正常FBSおよびCS-FBS中。このアッセイの開発を通じて、研究者らは、彼らのシステムを管理する特定の侵襲的な経路へのより多くの洞察を得ることができます。
ホルモン、成長因子、およびサイトカインは、多くの場合、腫瘍促進8として分類されている。 EGFのようなこれらの要因のいくつかは、浸潤チャンバー9における化学誘引物質の直接の供給源として使用される。したがって、これらは、直接腫瘍浸潤、血清の主要成分を表す可能性が高いようである。このプロトコルは、研究者は、癌細胞の浸潤能を媒介する、ホルモン、成長因子、およびサイトカインの関与を評価することができ、従来のインビトロ浸潤アッセイにシンプルであり、有意な変更を提案している。しかしながら、アッセイは、貴重な時間とrを使用しないように、手順は、分析の初期段階で彼らの研究のために有効であるかどうかについての回答と調査者を提供するように設計されesources場合は不要と考えられる。この方法では、CS-FBSを使用し、潜在的に癌細胞の浸潤を仲介リード候補として追求する分子れるように研究者の裁量に依存しています。これらの分析の結果は、血清成分が特定の細胞株または変異体の化学誘引物質または阻害剤が検討されているとして機能する特定するのに有用であることを証明する必要があります。さらに、このアプローチは、研究者が癌細胞浸潤を促進または阻害のいずれかの重要なシグナル伝達経路の特定に役立つことができる。したがって、将来の薬剤設計を演出。
Protocol
Representative Results
Discussion
腫瘍転移は、多段階プロセスである。細胞は、それらが離れた部位に輸送されている基底膜、リンパ系または血液の微小血管のいずれかにintravasate、を突破しなければならない。腫瘍細胞は、その後滲出とmacrometastasis 12に植民地化する。間葉移行（EMT）、腫瘍の浸潤、および転移に対する上皮を通じて進行はステロイドホルモン13,14によって強化された、成長は15〜18、</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources from D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.
Materials
| Item | Vendor | Catalog # | Comments/Description |
| BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates) |
Corning | 354578 | polyethylene teraphthalate (PET) membranes |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin |
| Fetal bovine Serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
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