Twee-Photon<em> In vivo</em> Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding
Summary
Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.
Abstract
In de zoogdieren cortex neuronen vormen extreem gecompliceerde netwerken en informatie uitwisselen bij synapsen. Veranderingen in synaptische sterkte, evenals toevoeging / verwijdering van synapsen, plaatsvinden in een ervaringsafhankelijke wijze die de structurele basis van neuronale plasticiteit. Als postsynaptische onderdelen van de exciterende synapsen in de cortex, worden dendritische beschouwd als een goede benadering van synapsen zijn. Het nemen van de voordelen van de muis genetica en fluorescentielabelling technieken, individuele neuronen en hun synaptische structuren kunnen in de intacte hersenen worden geëtiketteerd. Hier introduceren we een transcraniële imaging protocol met behulp van twee-foton laser scanning microscopie om fluorescent gelabelde postsynaptische vertakte stekels in de tijd in vivo te volgen. Dit protocol maakt gebruik van een uitgedund-schedel voorbereiding, waarbij de schedel intact houdt en voorkomt inflammatoire effecten veroorzaakt door blootstelling van de hersenvliezen en de cortex. Daarom beelden kunnen direct na su verworvenrgery wordt uitgevoerd. De experimentele procedure kan herhaaldelijk worden uitgevoerd op verschillende tijdstippen, variërend van enkele uren tot jaren. De toepassing van dit preparaat kan ook worden uitgebreid tot verschillende corticale gebieden en lagen, alsmede andere celtypes, onder fysiologische en pathologische omstandigheden.
Introduction
De zoogdieren cortex participeert in vele hersenfuncties, van zintuiglijke waarneming en controle voor het abstracte informatieverwerking en cognitie. Verschillende corticale functies bouwen op verschillende neurale circuits, die zijn opgebouwd uit verschillende soorten neuronen communiceren en uitwisselen van informatie op individueel synapsen. De structuur en functie van synapsen consequent worden gewijzigd ingevolge ervaringen en pathologieën. In de volwassen hersenen, synaptische plasticiteit in de vorm van zowel kracht veranderingen en toevoeging / verwijdering van synapsen, spelen een belangrijke rol bij de vorming en instandhouding van een functionele neurale circuits. Dendritische stekels zijn de postsynaptische onderdelen van de meerderheid van exciterende synapsen in de hersenen van zoogdieren. De constante omzet en morfologische veranderingen van de stekels worden verondersteld om te dienen als een goede indicator van veranderingen in synaptische verbindingen 1-7.
Twee-foton laser scanning microscopie biedt diepe penetratie door dikke, ondoorzichtige voorbereidingen en lage fototoxiciteit, waardoor het geschikt is voor live-imaging in de intacte hersenen 8 maakt. In combinatie met fluorescentielabelling, twee-foton beeldvorming biedt een krachtig instrument om een kijkje in het levende brein en volg structurele reorganisatie bij individuele synapsen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Verschillende methoden zijn gebruikt om muizen te bereiden voor levende beeldvorming 9-13. Hier beschrijven we een uitgedunde schedel voorbereiding van in vivo twee-foton beeldvorming om de structurele plasticiteit van postsynaptische vertakte stekels in de muis cortex onderzoeken. Met deze benadering hebben onze recente studies een dynamisch beeld van dendritische spine veranderingen weergegeven in reactie op motorische vaardigheden leren Met de toenemende beschikbaarheid van met fluorescent gelabelde neuronale subsets en snelle ontwikkeling van in vivo labeling technieken transgene dieren, kan dit hier beschreven ook worden toegepast te onderzoekente andere celtypes en corticale gebieden, gecombineerd met andere manipulaties, alsook in ziektemodellen 16-23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om een succesvolle uitgedund-schedel voorbereiding te verkrijgen, verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal. 1) De dikte van de schedel. Het schedelbot heeft een sandwich-structuur, met twee lagen van high-density compact bot en een middelste laag van lage-dichtheid sponsachtig bot. De hoge-snelheid micro boormachine is geschikt voor het verwijderen van de buitenlagen van compact bot en sponsachtig been, de microchirurgische blad is ideaal voor het verdunnen van de binnenlaag van compacta. Aangezien de d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken James Perna voor de grafische illustratie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Mental Health aan YZ
Materials
| Ketamine | Bioniche Pharma | 67457-034-10 | Mixed with xylazine for anesthesia |
| Xylazine | Lloyd laboratories | 139-236 | Mixed with ketamine for anesthesia |
| Saline | Hospira | 0409-7983-09 | 0.9% NaCl for injection and imaging |
| Razor blades | Electron microscopy sciences | 72000 | Double-edge stainless steel razor blades |
| Alcohol pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | Sterile alcohol prep pads |
| Eye ointment | Henry Schein | 102-9470 | Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant |
| High-speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area |
| Micro drill steel burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | 1.4 mm diameter |
| Microsurgical blade | Surgistar | 6961 | The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone |
| Cyanoacrylate glue | Fisher Scientific | NC9062131 | Fix the head plate onto the skull |
| Suture | Havard Apparatus | 510461 | Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| CCD camera | Infinity | ||
| Two-photon microscope | Prairie Technologies | Ultima IV | |
| 10X objective | Olympus | NA 0.30, air | |
| 60X objective | Olympus | NA 1.1, IR permeable, water immersion | |
| Ti-sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP |
Riferimenti
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
- Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
- Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
- Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
- Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
- Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
- Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
- Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
- Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
- Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
- Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
- Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
- Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
- Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
- Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).
