Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
Die subkutane Matrigel Plug-Assay in Mäusen, ist ein Verfahren der Wahl für die in vivo-Bewertung von pro- und anti-angiogene Faktoren. Bei diesem Verfahren werden die gewünschten Faktoren Kaltflüssigkeits ECM-mimische Gel, das nach subkutaner Injektion verfestigt, um eine Umgebung imitiert die Krebs Milieu bilden eingeführt. Diese Matrix ermöglicht das Eindringen von Wirtszellen, wie beispielsweise Endothelzellen und damit die Bildung von Gefäßen.
Hierbei schlagen wir eine neue modifizierte Matrigel Stecker Assay, der ausgenutzt werden kann, um die angiogene Potential von einem Pool von Faktoren, die durch die Krebszellen sezerniert zu illustrieren, im Gegensatz zu einem bestimmten Faktor (zB bFGF und VEGF) bzw. Agenten. Der Stecker enthält ECM-Mimik-Gel verwendet, um den Host (zB Maus) mit einem Pool von Faktoren, auf die CM schnell wachsender Tumor erzeugende Glioblastomzellen abgesondert einzuführen. Wir haben zuvor beschriebenen einen ausführlichen Vergleich der angiogene Potential vonU-87 MG menschlichen Glioblastom und deren ruhenden abgeleiteten Klon, in diesem Systemmodell, welches induzierte Angiogenese in der U-87-MG-Elternzellen. Das CM wird durch Filtern gesammelt Medien aus zusammenfließenden Gewebekulturplatten mit einer der beiden Zelllinie nach 48 Stunden Inkubation vorbereitet. Daher enthält sie nur Faktoren von den Zellen sezerniert wird, ohne die Zellen selbst. Beschrieben wird hier die Kombination von zwei bildgebenden Verfahren, Microbubbles kontrastverstärkte Ultraschallbilderzeugung und intravitalen fibered konfokale endomicroscopy für eine genaue Echtzeit-Charakterisierung des Ausmaßes, der Morphologie und Funktionalität der neu gebildete Blutgefäße innerhalb der Stecker.
Introduction
Das Matrigel Stecker Angiogenese-Test wurde zuerst von Kibbey et al. 1992, wo es verwendet wurde, um die Angiogenese-Stimulation durch das Peptid SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1 zu bewerten. Im Gegensatz zu anderen in vivo-Angiogenese-Assays, wie die Maus korneale Angiogenese oder Hühner-Chorioallantoismembran-Assays, ist dieser Test relativ leicht, 2 um. Das injizierte ECM-mimische Gel kann Zellen pro-angiogenen oder einer anti-angiogenen Verbindungen und / oder Faktoren enthalten. Bei der Beurteilung der Aktivität eines anti-angiogenen Verbindungen, enthält der Stecker in der Regel eine Mischung aus den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und der anti-angiogene Substanz kann direkt in den Stopfen oder systemisch 3 verabreicht werden, 4.
Das ECM-Mimik Gel wird subkutan injiziert, wo es innerhalb von Minuten erstarrt. Beurteilung der Blutgefäß Rekrutierung in der resultierenden Stecker typically durch Messen der Hämoglobinspiegel innerhalb des Steckers, durch Fluoreszenzsignalmessung nach der Injektion von mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markiertem geführt Dextran durch Immunfärbung Histologieschnitten für Endothelzellen-spezifische Marker oder durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) 2,5, 6. Allerdings erlaubt diese Einschätzung nur Endpunktanalyse und es fehlt Informationen über die Funktionalität und die Morphologie der Blutgefäße. Zusätzlich wurden Messungen des Plasmavolumens, entweder durch Hämoglobinniveaus oder durch Verwendung von Dextran-FITC als Indikator kann irreführend sein, da Blutgehalt wird durch die Größe der Blutgefäße und der Umfang der stagnierenden Pools von Blut beeinflusst. Dies ist besonders wichtig, wenn die angeworben Gefäßsystem wird durch die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt 7 gekennzeichnet.
Wir hier schlagen eine neue, genauere, Verfahren zur Visualisierung der eingestellten Blutgefäße durch die Kombination von zwei sich ergänzenden bildgebenden Verfahren. High auflösenden Mikrokontrastverstärkten Ultraschall (US) in Kombination mit intravital fibred-konfokale Endomikroskopie können nicht nur Informationen über Blutgefäßdichte, sondern auch auf ihre Morphologie und Funktionalität bieten. Darüber hinaus kann diese Analyse zu verschiedenen Zeitpunkten, wodurch so die Überwachung der Angiogenese-Kinetik erfolgen. US ist eine weit verbreitete Bildgebungsmodalität, die eine hohe räumliche Auflösung für Blutgefäße Bildgebung nach intravenöser (iv) Injektion von Mikrobläschen, die sich ausschließlich in dem vaskulären Kompartiment 8-11 bleiben besitzt. Die Mikrobläschen sind gasgefüllten Mikrobläschen, die eine starke echogenen Signal, wenn sie mit einem US-Puls angeregt und damit als gutes Kontrastmittel dienen. 3D-Bilder des Steckers mit dem US-Bildgebungssystem-Software folgende Mikroblasen Zerstörung erworben. Die resultierenden Bilder werden aus Bildfeldern vor und nach der Zerstörung von Mikroblasen besteht und geben den Unterschied im Videointensität in der Farbe. Diese überlagertBilder werden von der Software automatisch angezeigt. Folglich kann der Prozentsatz an funktionellen Gefäße innerhalb des Steckers zu quantifizieren. Hohe Auflösung fibered konfokalen Endomikroskopie dient als komplementäre Bildgebungsverfahren durch die Berichterstattung auf die Blutgefäße Morphologie. In diesem minimal invasiven Verfahren werden die Bilder nach intravenöser Verabreichung von FITC-konjugiertem Dextran 12 erworben. Die fluoreszierende Polymerfarbstoffe in die Blutbahn und dient als "Kontrastmittel" für die Blutgefäße der Morphologie und der Blutfluss bei. Da darüber hinaus die injizierte Polymer in einer Größe von 70 kDa, es kommt immer nur undichte Gefäße nach Tumorvaskulatur gefunden. Dies wird in hohem Hintergrund von der FITC-markiertem Dextran außerhalb der Blutgefäße führen. Folglich kann fibered konfokalen endomicroscopy verwendet, um typische Eigenschaften des EPR-Effekt in Tumor neovasculature- vergrßerte undicht, hoch verheddert Gefäße sichtbar zu machen, mit stumpfen Enden ist.
Das Systemmodell beschrie wurdeBett im Vergleich der angiogene Potential von U-87-MG-menschlichen Glioblastom und deren ruhenden Klon 13. Gefäßbildung in den Steckern bewertet 3 Wochen veröffentlichen ECM-Mimik Gel Impfung. Es wurde gezeigt, dass die Vaskularisierung in Stecker mit CM von U-87-MG schnell wachsenden Tumor erzeugenden Zellen wurde hinsichtlich der Anzahl, Dichte und Funktionalität wesentlich erhöht, wenn sie mit der Vaskularisierung innerhalb Stecker mit CM von den ruhenden Tumorerzeugenden Zellen verglichen. Daher konnten die Autoren schließen, dass CM, isoliert aus U-87-MG schnell wachsenden Tumor erzeugenden Zellen enthält höhere pro-angiogenen Faktoren, verglichen mit dem CM von ruhenden Tumorerzeugenden Zellen. Diese Faktoren stimulieren die Bildung von funktionellen Blutgefäße durch positiv auf alle Schritte der angiogenen Kaskade (dh Proliferation, Sprießen, Migration und schließlich die Bildung von röhrenförmigen Strukturen von Endothelzellen).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kombination von komplementären Bildgebungsverfahren ermöglicht den Erwerb von Informationen über die verschiedenen Komponenten der Angiogenese "Gefäßdichte, Funktion und Morphologie. Lade CM auf ECM-mimische Gelpfropfen erzeugt ein Tumor-Mikroumgebung, die aus anderen Zellpopulationen getrennt ist, wie Endothelzellen, die in den Stecker rekrutiert werden und extravasate.
Durch Ausführen, parallel Mikrobläschen kontrastverstärkten Bildgebung und US fibered konfokalen endomicr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
Riferimenti
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
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