مراقبة وظائف والصرف من الأوعية الدموية تجنيده من قبل العوامل التي يفرزها الخلايا المولدة للورم النمو السريع
Summary
We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).
Abstract
وmatrigel تحت الجلد المكونات الفحص في الفئران هو الأسلوب المفضل لفي التقييم في الجسم الحي من العوامل المؤيدة والمضادة للعائية. في هذه الطريقة، يتم إدخال العوامل المطلوبة في السائل البارد ECM تقليد الجل الذي، بعد الحقن تحت الجلد، يتصلب لتشكيل بيئة محاكاة الوسط السرطان. هذه المصفوفة تسمح تغلغل الخلايا المضيفة، مثل الخلايا البطانية، وبالتالي، وتشكيل الأوعية الدموية.
وهنا نقترح تعديل مقايسة matrigel المكونات الجديدة التي يمكن استغلالها لتوضيح إمكانات عائية من مجموعة من العوامل التي يفرزها الخلايا السرطانية، بدلا من عامل معين (على سبيل المثال، bFGF وVEGF) أو وكيل. ويستخدم المكونات التي تحتوي على ECM تقليد هلام لتقديم المضيف (أي الماوس) مع مجموعة من العوامل يفرز إلى CM خلايا ورم أرومي دبقي مدرة للورم سريعة النمو. وصفناها سابقا المقارنة واسعة من إمكانيات عائية منU-87 MG ورم أرومي دبقي البشري واستنساخ لها نائمة المشتقة، في هذا النموذج نظام، والتي تبين الأوعية الدموية التي يسببها في U-87 خلايا MG الأبوية. تم إعداد CM من خلال تصفية وسائل الإعلام التي تم جمعها من لوحات زراعة الأنسجة متكدسة إما خط الخلية التالية 48 ساعة الحضانة. وبالتالي، فإنه يحتوي على العوامل الوحيدة التي يفرزها الخلايا، دون الخلايا نفسها. الموصوفة هنا هو مزيج من اثنين من طرائق التصوير، microbubbles محسنة النقيض التصوير بالموجات فوق الصوتية وحيوي داخلي-فيبيريد متحد البؤر endomicroscopy، لدقيقة، في الوقت الحقيقي توصيف ما، مورفولوجيا وظائف الأوعية الدموية التي شكلت حديثا داخل المقابس.
Introduction
ووصف الأوعية الدموية matrigel المكونات فحص أول مرة من قبل Kibbey وآخرون في عام 1992، حيث كان يستخدم لتقييم تحفيز الأوعية الدموية التي SIKVAV الببتيد (سر إيل-ليز-فال-علاء-فال) 1. وعلى النقيض من غيرها من فحوصات الأوعية الدموية في الجسم الحي، مثل الأوعية الدموية القرنية الماوس أو فرخ المقايسات غشاء سقائية مشيمائية، هذا الاختبار هو سهل نسبيا لأداء 2. قد تحتوي على حقن ECM تقليد هلام الخلايا، الموالية للعائية أو المركبات المضادة للعائية و / أو عوامل. عند تقييم نشاط مركب المضادة للعائية، والمكونات يحتوي عادة على مزيج من العوامل الوعائية البطانية النمو (VEGF)، وعامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل)، ويمكن أن تدار على مادة مضادة للعائية مباشرة في المكونات أو جهازيا 3، 4.
يتم حقن هلام ECM تقليد تحت الجلد حيث يتصلب في غضون دقائق. تقييم التوظيف الأوعية الدموية في قابس الناتج هو typicallذ يؤديها قياس مستويات الهيموغلوبين ضمن المكونات، من خلال قياس إشارة مضان بعد الحقن من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -labeled ديكستران، من خلال المناعية من أقسام علم الأنسجة لعلامات البطانية محددة أو عن طريق خلية مضان تنشيط الفرز (FACS) 2،5، 6. ومع ذلك، هذا التقييم يسمح فقط تحليل نقطة النهاية ويفتقر إلى المعلومات حول الوظائف ومورفولوجية الأوعية الدموية. وبالإضافة إلى ذلك، قياسات حجم البلازما، إما عن طريق مستويات الهيموجلوبين أو باستخدام ديكستران-FITC كمؤشر، قد تكون مضللة إذ يتأثر المحتوى الدم عن طريق حجم الأوعية الدموية ومدى البرك الراكدة من الدم. هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا عندما يتميز الأوعية الدموية تجنيده من قبل نفاذية تعزيز والاستبقاء (EPR) تأثير 7.
نحن هنا اقتراح جديد أكثر دقة، طريقة لرؤية الأوعية الدموية تجنيدهم من خلال الجمع بين اثنين من طرائق التصوير التكميلية. HIGmicrobubbles ح-قرار تعزيز التباين الموجات فوق الصوتية (US) جنبا إلى جنب مع حيوي داخلي fibred-متحد البؤر endomicroscopy يمكن أن توفر المعلومات ليس فقط عن كثافة الأوعية الدموية، ولكن أيضا على التشكل والوظيفة. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن يؤديها هذا التحليل في عدة نقاط الوقت وبالتالي تمكين رصد حركية تكوين الأوعية الدموية. الولايات المتحدة هي طريقة التصوير المستخدمة على نطاق واسع التي تمتلك قرار مكانية عالية لتصوير الأوعية الدموية التالية في الوريد (IV) حقن microbubbles التي تبقى حصرا في مقصورة الأوعية الدموية 8-11. وmicrobubbles هم microbubbles مملوءة بالغاز التي تنتج إشارة مولد للصدى قوية عندما متحمس مع نبض الولايات المتحدة، وبالتالي تكون بمثابة عامل تباين جيد. يتم الحصول على صور 3D من المكونات باستخدام برنامج نظام التصوير الولايات المتحدة في أعقاب الدمار microbubbles. وتتكون الصور الناتجة عن إطارات صورة قبل وبعد التدمير من microbubbles ويعكس الاختلاف في كثافة الفيديو في اللون. هذه يغطىيتم عرض الصور تلقائيا من قبل البرنامج. ونتيجة لذلك، يمكن كميا في المئة من السفن وظيفية ضمن المكونات. عالية الدقة فيبيريد endomicroscopy متحد البؤر بمثابة طريقة التصوير التكميلية من خلال الإبلاغ عن الأوعية الدموية التشكل. في هذا الأسلوب مينيملي، يتم الحصول على الصور التالية الادارة الرابع من ديكستران FITC مترافق 12. البوليمر الفلورسنت الأصباغ مجرى الدم، وبالتالي بمثابة "عامل تباين" لالأوعية الدموية التشكل وتدفق الدم. وعلاوة على ذلك، منذ البوليمر حقن هو في حجم 70 كيلو دالتون، يمكن أن عبور السفن فقط راشح كما وجدت في ورم الأوعية الدموية. وهذا يؤدي إلى خلفية عالية من ديكستران FITC المسمى خارج الأوعية الدموية. ونتيجة لذلك، فيبيريد endomicroscopy متحد البؤر يمكن استخدامها لتصور الخصائص النموذجية للتأثير EPR في الورم neovasculature- الموسع، تتسرب منها المياه، والأوعية متشابكة للغاية، مع نهايات حادة.
تم descri هذا نموذج النظامالسرير في مقارنة بين إمكانات عائية من U-87 MG ورم أرومي دبقي البشري واستنساخ نائمة لها (13). تم تقييم الأوعية الدموية داخل المقابس ثلاثة أسابيع بعد ECM تقليد هلام التلقيح. وقد تبين أن الأوعية الدموية داخل المقابس التي تحتوي CM من U-87 MG تم زيادة الخلايا المولدة للورم كبير من حيث العدد والكثافة وظيفة، بالمقارنة مع الأوعية الدموية داخل المقابس التي تحتوي CM من الخلايا المولدة للورم نائمة سريعة النمو. وبالتالي، كانت قادرة على استنتاج أن CM معزولة من المؤلفين U-87 MG سريعة النمو الخلايا المولدة للورم يحتوي على مستويات أعلى من العوامل المؤيدة للعائية، مقارنة مع CM من الخلايا المولدة للورم نائمة. هذه العوامل تحفز تشكيل الأوعية الدموية وظيفية عن طريق التأثير إيجابيا جميع الخطوات من تتالي عائية (أي انتشار، تبرعم، والهجرة، وأخيرا، وتشكيل هياكل أنبوبية من الخلايا البطانية).
Protocol
Representative Results
Discussion
الجمع بين أساليب التصوير التكميلية يسمح تحصيل معلومات عن microvessel كثافة، وظائف الأوعية الدموية مكونات مختلفة "والتشكل. CM تحميل على المقابس هلام ECM تقليد يولد المكروية الورم، التي لا يفصلها عن السكان الخلية الأخرى، مثل الخلايا البطانية، أن يتم تجنيد ويتسرب إلى المكو…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Satchi-Fainaro research laboratory is partially supported by The Association for International Cancer Research (AICR), German-Israel Foundation (GIF), THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award, and by grants from the Israeli National Nanotechnology Initiative (INNI), Focal Technology Area (FTA) program: Nanomedicine for Personalized Theranostics, and by The Leona M. and Harry B. Helmsley Nanotechnology Research Fund.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Rotary Vacuum Evaporator | – | – | – |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 40C on ice |
| Depilatory cream | – | – | – |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | – | – |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | – | – |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | – |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 seconds using Vialmix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | – | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | – | – |
| 70 kD FITC-labeled Dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | – |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | – | – |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B |
Riferimenti
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
- Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
- Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).
