Nanomanipulatie van Single RNA-moleculen door een optisch pincet

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

Een groot deel van het menselijk genoom getranscribeerd maar niet vertaald. In deze post genoom era, hebben regulerende functies van RNA is aangetoond dat steeds belangrijker te worden. Al RNA functie hangt vaak het vermogen om alternatieve structuren aannemen, is het moeilijk om RNA driedimensionale structuren direct van sequentie voorspeld. Single-molecule zal tonen mogelijkheden om het probleem van RNA structurele polymorfisme oplossen bewaken molecuulstructuren een molecuul tegelijk. Dit werk toont een werkwijze voor het vouwen en de structuur van afzonderlijke RNA-moleculen met optisch pincet nauwkeurig manipuleren. Eerste, methoden om te synthetiseren moleculen geschikt voor single-molecule mechanische werkzaamheden worden beschreven. Vervolgens diverse kalibratie procedures om de goede werking van de optische pincetten zorgen worden besproken. Vervolgens worden verschillende experimenten toegelicht. Om het nut van de techniek aan te tonen, resultaten van mechanisch ontvouwen RNA haarspelden en een enkele RNA Kissing complex worden gebruikt als bewijs. In deze voorbeelden werd de Nanomanipulatie techniek om vouwen van elk structureel domein, zoals secundaire en tertiaire studie onafhankelijk. Tenslotte, de beperkingen en toekomstige toepassingen van de werkwijze worden besproken.

Introduction

De ontwikkeling van de optische pincetten techniek lang gepaard met de toepassing in biologisch onderzoek. Als de optische trapping effect voor het eerst werd ontdekt, Arthur Ashkin geconstateerd dat bacteriën in besmet water kan worden opgesloten in de laserfocus ^1. Sindsdien trapping bacteriën is uitgegroeid tot een onbedoelde, leuk experiment voor de generaties van biofysica studenten als een serieuze research tool om microbiële fysiologie ^2,3 bestuderen. De optische trapping techniek maakt gebruik van gefocusseerde laserbundel een microscopisch object ¹ immobiliseren. Praktisch, een laser trap functioneert als een optische bron, controleert tevens kracht (F) op het ingesloten object door de verplaatsing van het centrum van de val (AX). Binnen een kort bereik, F = κ x AX, di κ is de veerconstante van de val. De optische val kan worden gebruikt in piconewton (pN) precisie kracht uitoefenen wanneer microscopic object en haar positie met nanometer (nm) nauwkeurigheid te meten. In de afgelopen twee decennia hebben een optisch pincet een van de meest gebruikte single-molecule technieken in biofysica geworden. De techniek is toegepast om vouwen en mechanica van DNA ^{4-6, 7-9} RNA en eiwitten te bestuderen ^10,11. Optische pincetten zijn ook gebruikt om DNA replicatie ^12, RNA transcriptie ¹³ en eiwitsynthese ^14,15, evenals vele andere biomoleculaire evenementen ^16-18 observeren.

Single-molecule benaderingen zijn werkzaam in RNA structureel onderzoek vooral naar de ruige vouwen energielandschap van RNA te verkennen. Een RNA-sequentie kan meestal vouwen in meerdere stabiele, elkaar uitsluitende structuren, door de eenvoudige chemische samenstelling en base paring regels van RNA. Het is lang bekend dat RNA structurele polymorfisme, zoals die voorkomt in riboswitches ^19,20, speelt een belangrijke rol in genregulatie. Een recent genoom-breed onderzoek is zo klein als een paar graden grote invloed structuur en eiwitsynthese van een groot deel van het cellulaire transcriptoom ²¹ bleek dat temperatuurschommelingen. Dit voorbeeld duidt dat de biologische rol van alternatieve RNA vouwen is misschien belangrijker en ingrijpender dan gedacht. Structurele polymorfisme echter een uitdaging voor de traditionele biochemische en biofysische benaderingen die gemiddeld in vele nieuwe moleculen te onderzoeken. Bijvoorbeeld, de "aan" en "uit" conformaties van een riboswitch elkaar uitsluiten. Een gemiddelde structuur afgeleid van heterogene structuren is waarschijnlijk een van de biologisch relevante conformeren lijken. Bovendien getranslateerde RNA en mRNA vormen meestal structuren. Hun interactie met eiwitten en regelgevende RNAs gevallen vereist ontvouwing van de bestaande structuur van de interactie. Daarom bestuderen RNA ontvouwen / hervouwing wordt een pertinenteafgifte van RNA biologie. Om een dergelijke uitdaging aan te gaan, is de enkel-molecuul benadering toegepast om RNA structurele polymorfisme ontrafelen door het bestuderen van een molecuul per keer ^22-27.

In vergelijking met de populaire single-molecule fluorescentie werkwijze pincet gebaseerd mechanische ontplooiing biedt een voordeel dat conformaties van afzonderlijke moleculen worden gemanipuleerd door toegepaste kracht en worden gemeten nanometerprecisie. Dit Nanomanipulatie capaciteit kan worden gebruikt voor het ontvouwen / vouwing van individuele structurele domeinen zodat de hiërarchische vouwen van een grote RNA kan worden ontleed ²⁸ volgen. Alternatief kan een enkele streng worden aan vouwen tot een van de verschillende conformaties; of een bestaande structuur kan mechanisch worden geïnduceerd opnieuw vouwen in een andere conformatie ^29. Onder biologische omstandigheden, kan een RNA-structuur af van de temperatuur veranderingen of ligand bindend worden gewijzigd. De mogelijkheid van het direct manipuleren moleculaire sTRUCTUUR opent een nieuwe locatie van RNA structurele studie. In principe andere mechanische technieken, zoals atomic force microscoop en magnetische pincet, kan ook worden gebruikt om vouwen van afzonderlijke RNA-moleculen te bestuderen. Echter worden dergelijke toepassingen grotendeels beperkt door de relatief lage ruimtelijke resolutie ^30.

De tewerkstelling van een optisch pincet maakt RNA structuren worden ontvouwd door mechanische kracht.

Het voordeel van mechanische ontplooiing is verscheidene malen. Kracht kan worden gebruikt om zowel secundaire en tertiaire structuren ontvouwen, terwijl metaalionen en ligand geïnduceerde vouwen voornamelijk beperkt tot tertiaire structuren. Temperatuur en denatureringsmiddel kan een aanzienlijke invloed hebben op de activiteiten van water en opgeloste stoffen. In tegenstelling, is kracht lokaal toegepast op moleculaire structuren verstoren; het effect van de werking op de omgeving is te verwaarlozen. Daarnaast is thermische smelten best gebruikt vouwen thermodynamica van kleine RNA structuren,dat optische pincetten werden gebruikt om RNA structuren bestuderen met verschillende afmetingen, variërend van een zeven-base-pair tetraloop haarspeld ²⁸ een 400-nucleotide ribozym ^31. Bovendien kan RNA structuren mechanisch worden ontvouwen bij mesofiele temperaturen. In tegenstelling tot RNA ontvouwen in een thermisch smeltende experiment wordt de temperatuur verhoogd typisch ver boven fysiologische temperaturen, die aanzienlijk verhoogt RNA hydrolyse, met name bij aanwezigheid van ^{Mg2 +} ionen.

Het is belangrijk op te merken dat de mechanische effect van werking afhankelijk van deze wordt toegepast op een structuur. De uitgeoefende kracht kantelt het vouwen energielandschap. Bijvoorbeeld, wanneer kracht wordt uitgeoefend op een haarspeld, de basenparen opeenvolgend gebroken, een tegelijk (figuur 1a). De scheuren vork verloopt langs de spiraalvormige as, die loodrecht op de uitgeoefende kracht. Wanneer daarentegen een minimale kussen complex onder spanning, de twee kussenbasenparen, die evenwijdig aan de uitgeoefende kracht is, geef de kracht load (Figuur 1b). De verschillende geometrieën van de haarspeld en kussen complex ten opzichte van de uitgeoefende kracht resultaat in hun verschillende mechanische respons, die kan worden gebruikt om secundaire en tertiaire vouwing ^28,32 onderscheiden. Het theoretische aspect van mechanische ontvouwen is eerder beoordeeld ^8,9,30. Dit werk beschrijft de fundamentele benaderingen voor het opzetten en uitvoeren van een single-molecule mechanische ontvouwen assay.

Experimentele opstelling. In ons experiment mechanisch trekken, het RNA monster pincet uit het RNA van belang geflankeerd door twee dubbelstrengs DNA / RNA handgrepen (figuur 2) ^7. De gehele molecuul kan worden vastgebonden aan twee oppervlak beklede micron-size kralen (Spherotech) via streptavidine-biotine en digoxigenine-anti-digoxigenine antilichaam interactions, respectievelijk. Een kraal wordt gehouden door een kracht meten van optische trap, terwijl de andere is op het puntje van een micropipet gehouden. De onderlinge afstand tussen de korrels kan worden veranderd door ofwel sturen van de val of verplaatsen van de micropipet. Met deze aanpak kan een enkele RNA-molecuul tethering de kralen worden uitgerekt en ontspannen.

Voorbereiding van de monsters. De synthese van RNA monsters voor pincet bevat enkele stappen (figuur 3). Eerst wordt de DNA-sequentie overeenkomend met het RNA van belang eerst gekloneerd in een plasmide vector. Vervolgens worden drie PCR-reacties uitgevoerd om de twee handvatten en een template voor transcriptie genereren. De transcriptie sjabloon omvat de handgreep regio's en de ingebrachte sequenties. De volledige lengte RNA wordt gesynthetiseerd door in vitro transcriptie. Ten slotte worden de RNA en chemisch gemodificeerde handgrepen samen gehybridiseerd met de moleculen te genereren voor pincet.

Kalibratie en uitvoering van de pincet. Het basisontwerp van de Minitweezers gebruikd in dit werk volgt die van de dual-beam optisch pincet ^33. Met veel verbeteringen, de Minitweezers bezitten buitengewone stabiliteit vergeleken met de eerste generatie optische pincetten. Een aantal onderzoeksgroepen in verschillende landen gebruiken de Minitweezers in hun single-molecule onderzoek ^14,15,34-37. De details van de bouw, kalibratie, en de werking van het apparaat, inclusief instructie video's, zijn beschikbaar op de "pincet Lab" website (http://tweezerslab.unipr.it). Hier, verbeteringen en kalibratie procedures die moeten worden uitgevoerd op dagelijkse basis worden beschreven.

Protocol

1 Voorbereiding van de RNA-moleculen voor Single-molecule Pincet Klonen van de sequentie van belang. Kloon de DNA sequentie die overeenkomt met RNA structuur in een vector. Synthese en zuivering van de transcriptie template. Samenstel transcriptie matrijs door PCR. [Plaats tabel 1 hier] Next, te zuiveren van de PCR producten met behulp van een PCR zuivering kit, en concentreer het monster tot> 200 ng / ul. Omdat het gezuiverde DNA wordt gebruikt voor transcriptie moet RNase vrij water worden gebr…

Representative Results

Beperkt door de ruimte, wordt Nanomanipulatie van enkelvoudige RNA-moleculen aangetoond door het tonen van alleen mechanische ontvouwen voorbeelden van RNA haarspelden en een RNA met een tertiaire structuur. Manipuleren Single Haarspeld Moleculen Zodra een ketting gelegd tussen de kralen, kan verlenging van en de kracht op de ketting worden gemanipuleerd met een door de gebruiker gedefinieerde protocol. Vier algemene manipulatie protocollen worde…

Discussion

Modificatie en probleemoplossing in voorbereiding van Uittrekkende Monsters

Keuze van Klonen Vector. Hoewel de opzet beschreven (figuur 3) geen speciale kloneringsvector vergen, de vector voorkeur intrinsieke T7 of T3-promotor te hebben voor het gemak van transcriptie, zodat een promoter via PCR kan worden geïntroduceerd op gewenste posities.

Volgorde en de lengte van de handgrepen. Er is geen specifieke …

Materials

Minitweezers	Steven B. Smith Engineering		http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card	National Instruments	USB-6351
Video card	National Instruments	PCI-1407
Labview programming software	National Instruments
NI Vision Builder	National Instruments
Laser engraver	Epilogue laser systems	Zing-16
PCR purification kit	Qiagen	28104
MEGAscript T7 kit	Life Technologies	AM1334
MEGAclear kit	Life Technologies	AM1908
Biotin-11-UTP	Thermo Fisher	FERR0081
T4 DNA polymerase	New England Labs	M0203
Streptavidin coated microsphere	Spherotech	SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere	Spherotech	DIGP-20-2
Size standard microspheres	Spherotech	PPS-6K
Kapton tape	Kaptontape.com	KPPTDE-1
No. 2 cover glass	Thermo Fisher	12-543D