Lineaire amplificatie-gemedieerde (LAM)-PCR is een methode ontwikkeld om de exacte positie van integratie virale vectoren in het genoom te identificeren. De techniek heeft zich ontwikkeld tot de superieure methode om klonale dynamiek in gentherapie patiënten, bioveiligheid van nieuwe vector technologieën, diversiteit T-cel, kanker stamcellen modellen, enz. te bestuderen
Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.
Lineaire amplificatie-gemedieerde PCR (LAM-PCR) kan identificeren en karakteriseren onbekende flankerende DNA grenzend aan bekende DNA van elke oorsprong. Meer specifiek heeft LAM-PCR ontwikkeld om virale vector integratielocaties lokaliseren (IS) binnen het gastheergenoom 1,2. Genetische elementen zoals retrovirussen of transposons integreren hun genoom in het genoom van de gastheer in een (semi-) willekeurige wijze 3-6. In veel gevallen is beslissend precies de positie waar deze vectoren geïntegreerd kennen. LAM-PCR is bewezen superieur aan andere technieken zoals ligatie-gemedieerde PCR 7 en varianten of inverse PCR 8 zijn. De gevoeligheid en robuustheid van deze werkwijze ontstaat omdat de eerste voorversterking van het vector-genoom kruispunten en magnetische selectie van geamplificeerde PCR producten. Zoals de alternatieve methoden vermeld, LAM-PCR is gebaseerd op het gebruik van restrictie-enzymen, een voorspanning introduceren in het ophalen aantal IS 9-11. Aldusslechts een subset van de IS repertoire (de integrome) kan worden gedetecteerd in een reactie. Deze voorspanning wordt geminimaliseerd door de parallelle analyse van een monster met behulp van optimale combinaties van restrictie-enzymen 9. Onlangs, een variant van de technologie genoemd niet-beperkende LAM-PCR (nrLAM-PCR) ontwikkeld dat het gebruik van restrictie-enzymen omzeilt en maakt onpartijdige genoom-brede analyse van een monster in een enkele reactie 9,12.
In het verleden, is LAM-PCR gebruikt om identificatie van de veroorzakende retrovirale geeft aanleiding tot leukemie bij enkele patiënten in klinische proeven voor gentherapie 13-15. Sindsdien is LAM-PCR aangepast identificeren IS van andere integrerende vectoren (lentivirale vectoren, transposons) en ook integratiepatronen passief integrerende vectoren zoals adeno-geassocieerde vectoren (AAV) of integrase-defecte lentivirale vectoren (IDLV) identificeren 16 -21. Toepassingen van LAM-PCR zijn wijd verspreid: traditionelely, de techniek wordt veel gebruikt om de klonale samenstelling van genetisch gemodificeerde cellen te bestuderen bij patiënten die gentherapie hebben ondergaan of om de bioveiligheid van nieuwe vector systemen te beoordelen door het ontrafelen van hun integratie gedrag 15,16,22-24. Onlangs, LAM-PCR ingeschakeld bepalen specificiteit en off-target activiteit van designer nucleases door een IDLV vangen test 25.
Bovendien LAM-PCR laat toe om gemakkelijk volgen het lot van een getransduceerde cel na verloop van tijd in een organisme. Dit maakt proto-oncogenen en tumorsuppressor genen en om hematopoiese of kanker stamcel biologie 26-28 bestuderen. Tenslotte, LAM-PCR aangepast aan T-cel receptor diversiteit studie in mensen 29 (en ongepubliceerde gegevens).
De intrinsieke kracht van de technologie wordt nog versterkt door het koppelen van de methode om diepe sequencing technologieën die het mogelijk maken het karakteriseren miljoenen onbekende flankerende DNA met single nucleotide rRESOLUTIE geheel genomen. In het volgende protocol beschrijven we stap voor stap de versterking en de identificatie van flankerende onbekende DNA voorbeeldig te identificeren lentivirale vector IS. Oligonucleotiden die in het protocol zijn opgesomd in tabel 1. Geëxtraheerde DNA of cDNA van elke bron kan worden gebruikt als DNA-matrijs voor LAM-PCR en nrLAM-PCR.
Het LAM-PCR-techniek maakt het identificeren van onbekende DNA-sequenties die een bekende DNA regio flankeren. Vanwege de hoge gevoeligheid gevolg van voorversterking van de verbindingen met specifieke primers hybridiseren bij de bekende DNA-sequentie, is het mogelijk amplificeren en detecteren zelfs zeldzame verbindingen naar de enkele cel. Integendeel, een polyklonaal situatie LAM-PCR kan duizenden verschillende knooppunten amplificeren in een enkele reactie.
Echter, door het gebruik van r…
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1 % wt/vol BSA |
6M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96 well plates |
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |