Линейного усиления опосредованного ПЦР - Локализация генетических элементов и характеристика Неизвестного фланговые ДНК
Summary
Линейно-амплификации опосредованной (ЛАМ)-ПЦР является метод, разработанный для определения точных координат интеграции вирусных векторов в геноме. Техника развивались, чтобы быть лучшим методом для изучения клоновых динамику у пациентов генной терапии, биобезопасности новых векторных технологий, Т-клеточного разнообразия, моделей стволовых раковых клеток, и т.д.
Abstract
Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.
Introduction
Линейно-амплификации опосредованной ПЦР (LAM-ПЦР) позволяет идентификации и характеристике неизвестный фланговый ДНК, прилегающей к известной ДНК любого происхождения. Более конкретно, LAM-ПЦР был разработан, чтобы локализовать вирусный вектор сайтов интеграции (IS) в геном хозяина 1,2. Генетические элементы, такие как ретровирусов или транспозонов интегрировать их геном в геном хозяина в (полу-) случайным образом 3-6. Во многих случаях это является решающим точно знать позицию, где интегрированную эти векторы. LAM-ПЦР было доказано, что превосходит альтернативных методов, таких как перевязки опосредованного ПЦР 7 и его вариантов или обратной ПЦР 8. Чувствительность и надежность этого метода возникает в результате первоначального предварительного усиления вектора-генома развязок и магнитного выбора усиленных продуктов ПЦР. Как и альтернативных методов, указанных, LAM-ПЦР основан на использовании ферментов рестрикции, введение ошибку в поисковой мощностью 9-11. Таким образом,только подмножество репертуара (integrome) могут быть обнаружены в одной реакции. Это смещение минимизируется параллельного анализа данного образца, используя оптимальные комбинации ферментов рестрикции 9. Недавно вариант технологии называют не ограничивающими LAM-ПЦР (nrLAM-PCR) была разработана, что обходит использование ферментов рестрикции и позволяет объективную генома анализ образца в одной реакции 9,12.
В прошлом LAM-ПЦР был использован для идентификации причинным ретровирусная порождает лейкемии у нескольких пациентов в клинических испытаниях генной терапии 13-15. С тех пор, LAM-ПЦР была адаптирована для выявления IS от других интегрирующих векторов (лентивирусные векторы, транспозонов), а также для выявления интеграционных моделей пассивно интеграции векторы, как аденоассоциированные векторов (AAV) или интегразы исправный лентивирусов (IDLV) 16 -21. Применение LAM-ПЦР широкое распространение: традиционнаялы, этот метод широко используется для изучения клональную состав генов изменение клеток у пациентов, которые подверглись генной терапии или для оценки биобезопасности новых векторных систем на распутывание их поведение интеграции 15,16,22-24. Недавно LAM-ПЦР позволили установить специфику и мимо ворот деятельность дизайнера нуклеаз путем IDLV захвата анализа 25.
Кроме того, LAM-ПЦР позволяет легко следить за судьбу трансдуцированной клетки с течением времени в организме. Это позволяет определить протоонкогенами а также гены-супрессоры опухолей, а также для изучения гемопоэза или раковых стволовых клеточной биологии 26-28. Не в последнюю очередь, LAM-ПЦР была адаптирована для изучения разнообразия Т-клеточный рецептор у человека 29 (и неопубликованные данные).
Внутренняя сила технологии подкрепляется связывая метод для глубоких технологий секвенирования, которые позволяют характеризующие миллионы неизвестного фланговые ДНК с одной нуклеотидной гesolution в целых геномов. В следующем протокола, мы опишем шаг за шагом усиление и определение сопутствующих неизвестный ДНК образцово определить лентивирусный вектор. Олигонуклеотиды, используемые в протоколе приведены в таблице 1. Экстрагированной ДНК или кДНК из любого источника может быть использован в качестве ДНК-матрицы для LAM-ПЦР и nrLAM-PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Техника LAM-ПЦР позволяет выявить неизвестные последовательности ДНК, которые фланкируют известный участок ДНК. Из-за высокой чувствительности в результате предварительного усиления из переходов с использованием специфических праймеров гибридизации в известной последовательности ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1 % wt/vol BSA |
| 6M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96 well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
