Linear Amplification Mediated PCR - Lokalisering av genetiske elementer og karakterisering av Unknown flankerer DNA
Summary
Lineær-mediert amplifikasjon (LAM)-PCR er en fremgangsmåte utviklet for å identifisere de nøyaktige posisjoner av integrering av virale vektorer i genomet. Teknikken har utviklet seg til å bli den overlegne metoden for å studere clonal dynamikk i genterapi pasienter, biosikkerhet av nye vektorteknologier, T-celle mangfold, kreft stamceller modeller, etc.
Abstract
Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.
Introduction
Lineær-mediert amplifikasjon PCR (LAM-PCR) gjør det mulig å identifisere og karakterisere ukjente flankerende DNA i tilknytning til kjente DNA fra hvilken som helst opprinnelse. Mer spesifikt, har LAM-PCR blitt utviklet for å lokalisere viral vektor integreringssteder (IS) i vertsgenomet 1,2. Genetiske elementer som retrovirus eller transposoner integrere deres genom i vertsgenomet i en (halv) tilfeldig måte 3-6. I mange tilfeller er det avgjørende å vite nøyaktig posisjonen hvor disse vektorer integrert. LAM-PCR har vist seg å være bedre enn alternative teknikker som ligation-mediert PCR 7 og dens varianter eller invers PCR åtte. Følsomheten og robusthet i denne metoden oppstår ved den innledende preamplification av vektor-genom veikryss og magnetisk utvalg av amplifiserte PCR-produkter. I likhet med de alternative fremgangsmåter som er nevnt, er avhengig LAM-PCR på bruk av restriksjonsenzymer, innføre en skjevhet i gjenfinning kapasitet IS 9-11. SåledesBare en undergruppe av IS repertoaret (den integrome) kan påvises i en reaksjon. Denne skjevhet blir minimalisert ved parallell analyse av en gitt prøve med optimale kombinasjoner av restriksjonsenzymer 9. Nylig ble en variant av teknologien betegnet ikke-begrensende LAM-PCR (nrLAM-PCR) er blitt utviklet som omgår bruken av restriksjonsenzymer og kan objektiv genom-wide-analyse av en prøve i en enkelt reaksjons 9,12.
I det siste har LAM-PCR blitt brukt til å identifisere den utløsende retroviral gir opphav til leukemi hos noen pasienter i kliniske genterapiforsøk 13-15. Siden da har LAM-PCR blitt tilpasset for å identifisere IS fra andre integrerende vektorer (lentiviral vektorer, transposon) og også for å identifisere integreringsmønstre passivt integrere vektorer som adeno-assosiert vektorer (AAV) eller integrasehemmere-defekt lentiviral vektorer (IDLV) 16 -21. Anvendelser av LAM-PCR er bred spredning: tradisjonellly, er teknikken mye brukt til å studere klonal sammensetningen av genmodifiserte celler hos pasienter som har gjennomgått genterapi eller å vurdere biosikkerhet av nye vektorsystemer ved å rakne deres integrering atferd 15,16,22-24. Nylig, aktivert LAM-PCR bestemme spesifisitet og off-target aktivitet av designer nukleaser av en IDLV fangst assay 25.
Videre tillater LAM-PCR for enkelt å følge skjebnen til en transduced celle over tid i en organisme. Dette gjør det mulig å identifisere proto-onkogener samt tumorsuppressorgener, og også for å studere hematopoiesis eller kreft stamcelle biologi 26-28. Sist men ikke minst, ble LAM-PCR tilpasset studere T-celle reseptor mangfold hos mennesker 29 (og upubliserte data).
Den iboende kraften i teknologien er forsterket ved å knytte metoden til dype sekvensering teknologier som gjør det mulig å karakterisere millioner av ukjent flankerer DNA med singel nucleotide resolution i hele genomer. I det følgende protokoll, vi beskriver trinnvis forsterkning og identifisering av flanke ukjent DNA exemplarily å identifisere lentiviral vektor IS. Oligonukleotider som benyttes i protokollen, er oppført i tabell 1. utpakkede DNA eller cDNA fra hvilken som helst kilde kan anvendes som DNA-templat for LAM-PCR og nrLAM-PCR..
Protocol
Representative Results
Discussion
LAM-PCR teknikken tillater identifisere ukjente DNA-sekvenser som flankerer et kjent DNA region. På grunn av den høye følsomhet som følge av preamplification av knutepunkter med spesifikke primere hybridiserer i den kjente DNA-sekvens, er det mulig å forsterke og detektere selv sjeldne veikryss ned til enkeltcelle-nivå. I motsetning, i et polyklonalt situasjon LAM-PCR er i stand til å forsterke tusenvis av forskjellige knutepunkter i en enkelt reaksjon.
Imidlertid, på grunn av bruk a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Taq DNA Polymerase | Genaxxon Bioscience GmbH | M3001.5000 | Alternative Taq Polymerases may be used |
| PCR Buffer | Qiagen | 201203 | Use of this buffer is recommended |
| dNTP-Mixture | Genaxxon Bioscience GmbH | M3015.4020 | or any other dNTPs |
| Oligonucleotides (Primers) | MWG Biotech | HPLC purified | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 11206D | |
| PBS | Gibco | 14190-086 | 0.1 % wt/vol BSA |
| 6M LiCl | Roth | 3739.1 | 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA |
| Tris-HCl, pH 7.5 | USB Corporation | 22637 | or any other supplier |
| EDTA | Applichem | A1103,0250 | or any other supplier |
| Klenow Polymerase | Roche Diagnostics | 10104523001 | |
| Hexanucleotide mixture | Roche Diagnostics | 11277081001 | |
| Restriction endonuclease | NEB | or any other supplier | |
| Fast-Link DNA ligation kit | Epicentre Biotechnologies | LK11025 | |
| CircLigase ssDNA Ligase Kit | Epicentre Biotechnologies | CL4111K | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | or any other supplier |
| Agarose LE | Roche Diagnostics | 11685660001 | or any other supplier |
| TBE buffer | Amresco | 0658 | or any other supplier |
| Ethidium bromide | Applichem | A2273,0005 | Ethidium bromide is mutagenic |
| 100 bp DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | or any other DNA ladder |
| 20 mM NaCl | Sigma-Aldrich | 71393-1L | or any other supplier |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158501 | for use with 1.5 ml Tubes |
| Magna-Sep Magnetic Particle Separator | Life Technologies | K158696 | for use with 96 well plates |
| Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane | Millipore | UFC503096 | |
| PerfectBlue Gelsystem Midi S | PeqLab | 40-1515 | or other electrophoresis system |
| TProfessional 96 | Biometra | 050-551 | or other Thermocycler for 96-well plates |
| Orbital shaker KS 260 basic | IKA | 2980200 | or other horizontal shaker |
| PCR softtubes 0.2 ml | Biozym Scientific GmbH | 711082 | or other 0.2 ml PCR tubes |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 12682 | or other 1.5 ml tubes |
| Gel documentation system | PeqLab | or any other gel documentation system | |
| Nanodrop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Spreadex EL1200 precast gel | Elchrom Scientific | 3497 | |
| Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 | Elchrom Scientific | 2001E | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
- Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
- Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
- Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
- Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
- Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
- Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
- Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
- Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
- Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
- Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
- Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
- Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
- Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
- Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
- Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
- Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
- Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
- Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
- Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
- Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
- Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).
