В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки
Summary
Логометрический бимолекулярные маяки (RBMBs) могут быть использованы для изображения отдельных инженерных РНК-транскриптов в живых клетках. Здесь мы опишем приготовление и очистку RBMBs, доставка RBMBs в клетки microporation и флуоресцентных изображений одиночных транскриптов РНК в режиме реального времени.
Abstract
Растущее осознание того, что как временной и пространственной регуляции экспрессии генов может иметь серьезные последствия на функции клеток привело к разработке различных методов визуализации отдельных транскриптов РНК в отдельных живых клеток. Одним из перспективных методов, который недавно был описан использует олигонуклеотидную основе оптического зонда, пропорциональный бимолекулярная маяк (RBMB), для обнаружения РНК-транскриптов, которые были инженерии, чтобы содержать по меньшей мере четыре тандемных повторов RBMB последовательности-мишени в 3'-нетранслируемой области. RBMBs специально разработаны для излучают яркий флуоресцентный сигнал при гибридизации к комплементарной РНК, но в остальном остаются угасает. Использование синтетического зонда в Такой подход позволяет фотостабилен, красное смещение, и очень эмиссионные органические красители, которые будут использоваться для работы с изображениями. Связывание нескольких RBMBs в инженерных РНК-транскриптов результатов в дискретных точках флуоресценции, если смотреть под широким полем флуоресцентного микроскопа. Следовательно, движение отдельных транскриптов РНК могут быть легко визуализированы в реальном времени с помощью принятия временной ряд флуоресцентных изображений. Здесь мы опишем приготовление и очистку RBMBs, доставка в клетки по microporation и жить-ячейки изображения отдельных транскриптов РНК.
Introduction
Выражение и регулирование РНК-транскриптов является сложным и динамичным процессом, в значительной степени отвечает за контроль на поведение клеток и судьбу. Хотя важность РНК в диктующей функции клеток была известна в течение некоторого времени, часто бывает трудно провести четкую связь между двумя, так как большинство инструментов анализа РНК хватает пространственное и временное разрешение, необходимое для захвата важных нормативных мероприятий, таких как транскрипции лопнул, РНК торговля, и локализованная обработка РНК. Это привело к появлению нескольких методов, которые позволяют отдельные транскрипты РНК, чтобы быть визуализированы в живых клетках в реальном времени 1. Пожалуй, самый известный из этих методов использует GFP-MS2 слитый белок, чтобы РНК-мишени, которая была разработана специально для содержат тандемные повторы сайта связывания MS2 в 3'-UTR 2,3. Собрав несколько молекул GFP в непосредственной близости, отдельные стенограммы РНК отображаться в виде ярких флуоресцентных пятенчерез флуоресцентной микроскопии. Система GFP-MS2 предоставил беспрецедентную понимание поведения РНК, в том числе прямой визуализации и измерения транскрипции разрыва 4,5, обнаружения уникальной субклеточном локализации и обработки 6-9 и в режиме реального времени визуализации РНК транспорта 10. Однако, несмотря на огромный потенциал системы GFP-MS2, несвязанные белки слияния GFP-MS2 может создать высокий фоновый флуоресцентный сигнал, который ограничивает универсальность и динамический диапазон этой техники. Несколько подходов были разработаны для ограничения этого фонового сигнала, в том числе субклеточной компартментализации несвязанного GFP-MS2 10, дополнения фрагмента белка 11 и альтернативных РНК связывающих белков и цели 12. Тем не менее, все эти подходы остаются чувствительными к относительной и общей экспрессии РНК-мишени и GFP-MS2 слитого белка.
В качестве аlternative к системам GFP-MS2, молекулярные маяки были также использованы для обнаружения инженерии РНК-транскрипты с тандемных повторов дополнительного сайта связывания в 3'-UTR 13,14. Молекулярные маяки шпильки формирования олигонуклеотидные зонды, которые помечены на одном конце с гасителем и на другом конце с флуоресцентным репортером. Когда не связан с РНК-мишени флуоресцентного репортера и гасителем оставаться в непосредственной близости, что приводит к низкой флуоресцентного состояния. После гибридизации, флуоресцентный репортер и утоления вынуждены друг от друга и флуоресценции восстанавливается. Как и в GFP-MS2 системы, связывание нескольких молекулярных маяков на одном результаты РНК-транскрипта в светлом месте флуоресцентного который может быть идентифицирован с помощью флуоресцентной микроскопии; Тем не менее, фон флуоресценции как ожидается, будет значительно ниже, за счет закаленного конфигурации несвязанных молекул маяков. К сожалению, несмотря на умной механизма активизации, который включен в мolecular дизайн маяк, в настоящее время все больше доказательств, что негибридизированным молекулярные маячки не остаются в шпильки конформации при введении в живые клетки. Следовательно, они создают ложное-положительных сигнал, что значительно снижает отношение сигнал-фон. Чтобы преодолеть этот недостаток, мы недавно разработали новый синтетический зонд для визуализации РНК в живых клетках, логометрических бимолекулярные маяки (RBMBs; Рисунок 1A) 15,16. RBMBs состоят из двух 2'-О-метил олигонуклеотидных цепей, которые образуют гибридную структуру с признаками как короткий шпильки РНК (ShRNA) и молекулярных маяков. Механизм петли и активация флуоресценции похожа на молекулярном маяка, в то время как длинные двухцепочечную область с выступом 3'-UU более характерно ShRNA. Особенности ShRNA предназначены для привода ядерный экспорт, который мы нашли, повышает внутренние жизнь, чтобы> 24 ч, с минимальным поддавалось разрушению, ипредотвращает неспецифическую открытие цикла. В результате RBMBs демонстрируют значительно более высокий сигнал-фон, чем молекулярных маяков.
Следует отметить, что RBMBs не может быть получена с использованием ДНК-олигонуклеотидов, так как ДНК-зондов на основе не обладают теми же ядерный потенциал Экспорт в РНК-зондов на основе. Конструктивно RBMB цикл, как правило, предназначены для между 15 и 21 баз длительного, чтобы создать баланс между специфичности и селективности при РНК гибридизации. Короткий стержень, который формирует из двух самодополнительных доменов обычно предназначен для 4 основания. Если выбран больший стебель, скорость гибридизации между RBMB петли и РНК-мишени значительно замедлился 17,18. С другой стороны, когда выбран более короткий стержень последовательность температура плавления часто слишком низким, чтобы поддерживать структуру стволовых петли при 37 ° С, что приводит к высокой фонового сигнала. Специфика RBMB также красныйuced как длина штока сокращается. Поскольку последовательности RBMB стволовых петли также может влиять производительность RBMB, она должна быть тщательно отобраны 19. В частности, последовательности идеальные петли должны иметь минимальную вторичную структуру, гибридизации с РНК последовательностей с минимальным вторичной структуры, избежать белковые сайты связывания, и избежать мимо цели связывания. Предсказания как RBMB и вторичной структуры РНК могут быть получены с помощью программного обеспечения, таких как mfold 20. Дополнительные мимо ворот сайты могут идентифицировать с помощью нуклеотидной Basic Local Назначение Search Tool (BLAST). Однако из-за несоответствия в модельных предсказаний и трудности в выявлении белка-выжидать сайтов, специфика всех RBMBs должны в конечном счете быть подтверждено экспериментально.
Если желательно, незамороженный ссылки краситель, который нечувствителен к состоянию гибридизации могут быть добавлены к RBMB 15. Добавление эталонного красителя может прOvide маркер для доставки зонда и использовать для радиометрического изображения, если требуются более точные измерения общего клеточного флуоресценции. Опорные красители позволяет выполнять измерения с поправкой на разницу в фоновом режиме благодаря клетки к клетке вариаций в комплект поставки. Тем не менее, при визуализации индивидуальный РНК-транскриптов ссылка на красителе не является необходимым. Примечательно, некоторые ссылки красители могут помешать экспорту RBMBs от ядра, что приводит к несколько более высоким фонового сигнала в ядре.
Когда разработана должным образом, RBMBs могут быть использованы для изображения индивидуальных РНК-транскриптов в отдельных живых клеток, если целевой РНК сконструирован так, чтобы содержать, по меньшей мере, четыре RBMB сайты связывания (рисунок 1b) 16. RBMBs может быть эффективно доставлен в широком диапазоне клеток типов через microporation, с практически не влияет на жизнеспособность 21 клеток, и количественные измерения экспрессии генов может бытьприобрела в течение 30 мин. Кроме того, методология довольно нечувствительна к концентрации RBMB и целевой РНК уровнях, так как флуоресценции от несвязанных RBMBs эффективно гасят. Здесь мы предлагаем подробное описание методологии, используемой для подготовки и очистки RBMBs, а также общий порядок на поставку RBMBs в живых клеток через microporation и визуализацию отдельных транскриптов РНК в режиме реального времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возможность изображений отдельных инженерных РНК-транскриптов в живых клетках с помощью обычного широкого поле микроскопа требуется яркое и фотостабилен флуоресцентный сигнал, связанный с каждым РНК-транскрипта и низкой флуоресцентного фона, исходящего из несвязанных флуоресцентн…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным научным фондом КАРЬЕРА премии (0953583) и Национального института здравоохранения NCI / R21-CA116102, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
Riferimenti
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
