Ratiometric bimolecular संकेतकों का उपयोग जीवित कोशिकाओं में एकल इंजीनियर शाही सेना टेप के वास्तविक समय इमेजिंग
Summary
Ratiometric bimolecular बीकन (RBMBs) जीवित कोशिकाओं में छवि एक इंजीनियर शाही सेना टेप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम RBMBs, microporation और वास्तविक समय में एक शाही सेना टेप के फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा कोशिकाओं में RBMBs के वितरण की तैयारी और शुद्धि का वर्णन.
Abstract
दोनों जीन अभिव्यक्ति के अस्थायी और स्थानिक विनियमन सेल समारोह पर महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते हैं कि बढ़ अहसास ही जीवित कोशिकाओं में व्यक्तिगत शाही सेना टेप कल्पना करने के लिए विभिन्न तकनीकों का विकास करने के लिए प्रेरित किया है. हाल ही में वर्णित किया गया है कि एक होनहार तकनीक 3'-untranslated क्षेत्र में RBMB लक्ष्य अनुक्रम के कम से कम चार मिलकर दोहराता शामिल करने के लिए इंजीनियर थे कि शाही सेना टेप का पता लगाने के लिए एक oligonucleotide आधारित ऑप्टिकल जांच, ratiometric bimolecular बीकन (RBMB), का इस्तेमाल करता. RBMBs विशेष रूप से पूरक शाही सेना को संकरण पर एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट संकेत फेंकना तैयार कर रहे हैं, लेकिन अन्यथा बुझती रहते हैं. इस दृष्टिकोण में एक कृत्रिम जांच के उपयोग के लाल स्थानांतरित, photostable की अनुमति देता है, और अत्यधिक छोड़नेवाला कार्बनिक रंजक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. एक व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जब असतत प्रतिदीप्ति स्थानों में इंजीनियर शाही सेना टेप परिणामों के लिए कई RBMBs के बंधन. नतीजतन, व्यक्तिगत शाही सेना टेप की आवाजाही आसानी से फ्लोरोसेंट छवियों का एक समय श्रृंखला लेने से वास्तविक समय में देखे जा सकते हैं. यहाँ हम microporation द्वारा कोशिकाओं में तैयारी और शुद्धि RBMBs की, वितरण का वर्णन है और लाइव सेल एकल शाही सेना टेप की इमेजिंग.
Introduction
शाही सेना टेप की अभिव्यक्ति और विनियमन सेल व्यवहार और भाग्य को नियंत्रित करने के लिए काफी हद तक जिम्मेदार है कि एक जटिल और गतिशील प्रक्रिया है. हुक्म सेल समारोह में शाही सेना के महत्व को कुछ समय के लिए जाना जाता रहा है, हालांकि, यह दो सबसे शाही सेना विश्लेषण उपकरणों ऐसे प्रतिलेखन फोड़ के रूप में महत्वपूर्ण विनियामक घटनाओं पर कब्जा करने के लिए आवश्यक स्थानिक और लौकिक संकल्प की कमी के बाद से, शाही सेना के बीच स्पष्ट कनेक्शन आकर्षित करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है तस्करी, और स्थानीय शाही सेना प्रसंस्करण. इस व्यक्ति ने शाही सेना टेप वास्तविक समय 1 में जीवित कोशिकाओं में देखे जा करने की अनुमति है कि कई तकनीकों के आगमन के लिए प्रेरित किया है. शायद, इन तकनीकों के सबसे प्रमुख 3'-UTR 2,3 में MS2 बाध्यकारी साइट का मिलकर दोहराता शामिल करने के लिए इंजीनियर किया गया है कि शाही सेना को लक्षित करने के लिए एक GFP-MS2 संलयन प्रोटीन का इस्तेमाल करता. करीब निकटता में कई GFP अणुओं लाकर, व्यक्तिगत शाही सेना टेप के रूप में उज्ज्वल फ्लोरोसेंट धब्बे दिखाई देते हैंप्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से. GFP-MS2 प्रणाली प्रत्यक्ष दृश्य और ट्रांसक्रिप्शनल की माप 4,5 फोड़, अद्वितीय उप सेलुलर स्थानीयकरण और प्रसंस्करण 6-9 का पता लगाने, और शाही सेना परिवहन 10 की वास्तविक समय इमेजिंग सहित शाही सेना व्यवहार में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि, प्रदान की गई है. हालांकि, GFP-MS2 प्रणाली की जबरदस्त क्षमता के बावजूद, अबाध GFP-MS2 संलयन प्रोटीन इस तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा और गतिशील रेंज की सीमा है कि एक उच्च पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट संकेत बना सकते हैं. कई दृष्टिकोण subcellular अपार GFP-MS2 10 की compartmentalization, प्रोटीन टुकड़ा complementation 11, और वैकल्पिक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन सहित, इस पृष्ठभूमि संकेत सीमित करने के लिए विकसित की है और 12 को लक्षित करता किया गया है. हालांकि, इन तरीकों के सभी शाही सेना लक्ष्य और GFP MS2 संलयन प्रोटीन के रिश्तेदार और कुल अभिव्यक्ति के प्रति संवेदनशील रहते हैं.
एक एक के रूप मेंGFP-MS2 प्रणाली को lternative, आणविक बीकन भी 3'-UTR 13,14 में पूरक बाध्यकारी साइट का मिलकर दोहराता इंजीनियर के साथ शाही सेना टेप का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. आणविक बीकन एक पेय के साथ एक छोर पर और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ दूसरे छोर पर चिह्नित कर रहे हैं कि बाल के लिये कांटा बनाने oligonucleotide जांच कर रहे हैं. पेय आरएनए फ्लोरोसेंट संवाददाता लक्ष्य और करने के लिए बाध्य नहीं है जब एक कम फ्लोरोसेंट राज्य में जिसके परिणामस्वरूप, पास में रहते हैं. संकरण करने पर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और पेय के अलावा मजबूर कर रहे हैं और प्रतिदीप्ति बहाल है. GFP-MS2 प्रणाली, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पहचाना जा सकता है कि एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट स्थान में एक भी शाही सेना प्रतिलेख परिणामों पर कई आणविक बीकन के बंधन के लिए इसी प्रकार; हालांकि, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कारण अपार आणविक बीकन की बुझती विन्यास के लिए, बहुत कम होने की उम्मीद है. दुर्भाग्य से, चालाक सक्रियण तंत्र के बावजूद कि मीटर में शामिल किया हैolecular बीकन डिजाइन, जीवित कोशिकाओं में पेश किया है जब बाल के लिये कांटा रचना में नहीं रहते हैं आणविक बीकन unhybridized कि बढ़ती सबूत मौजूद है. नतीजतन, वे काफी संकेत करने वाली पृष्ठभूमि कम कर देता है एक झूठी सकारात्मक संकेत उत्पन्न करते हैं. 15,16, इस कमी को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में जीवित कोशिकाओं, ratiometric bimolecular बीकन (चित्रा 1 ए RBMBs) में इमेजिंग शाही सेना के लिए एक नया सिंथेटिक जांच विकसित की है. RBMBs कम बाल के लिये कांटा शाही सेना (shRNA) और आणविक बीकन दोनों से सुविधाओं के साथ एक संकर संरचना है कि फार्म दो 2'-O-मिथाइल oligonucleotide किस्में से बना रहे हैं. एक 3'-UU की अधिकता के साथ लंबे समय तक डबल असहाय डोमेन shRNA की विशेषता है, जबकि पाश और प्रतिदीप्ति सक्रियण तंत्र, आणविक बीकन के समान है. shRNA सुविधाओं न्यूनतम नमूदार गिरावट के साथ हम> 24 घंटा तक बढ़ जाती है intracellular जीवन भर पाया है जो परमाणु निर्यात,, ड्राइव करने के लिए तैयार है, और कर रहे हैंपाश की गैर विशिष्ट उद्घाटन रोकता है. एक परिणाम RBMBs आणविक बीकन से एक काफी उच्च संकेत करने वाली पृष्ठभूमि प्रदर्शन के रूप में.
RBMBs आरएनए आधारित जांच के रूप में ही परमाणु निर्यात क्षमताओं के पास नहीं है डीएनए आधारित जांच के बाद, डीएनए oligonucleotides उपयोग कर तैयार नहीं किया जा सकता कि यह ध्यान दिया जाना चाहिए. Structurally, RBMB पाश आमतौर पर शाही सेना संकरण पर विशिष्टता और चयनात्मकता के बीच एक संतुलन बनाने के लिए, लंबे समय 15 और 21 ठिकानों के बीच बनाया गया है. दो स्वयं पूरक डोमेन से रूपों कि कम स्टेम आमतौर पर 4 ठिकानों होने के लिए बनाया गया है. एक लंबे समय तक स्टेम चुना जाता है, RBMB पाश और लक्ष्य शाही सेना के बीच संकरण की दर काफी 17,18 धीमा है. एक छोटी स्टेम अनुक्रम चुना जाता है जब इसके विपरीत, पिघलने तापमान एक उच्च पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए अग्रणी, 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टेम पाश संरचना को बनाए रखने के लिए अक्सर बहुत कम है. RBMB की विशिष्टता भी लाल हैस्टेम लंबाई छोटा है के रूप में uced. भी RBMB प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते RBMB स्टेम पाश के अनुक्रम के बाद से, यह सावधानी से 19 का चयन किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, आदर्श पाश दृश्यों, कम से कम माध्यमिक संरचना होनी चाहिए कम से कम माध्यमिक संरचना के साथ शाही सेना दृश्यों को संकरण, प्रोटीन बाध्यकारी साइटों से बचने, और बाध्यकारी बंद लक्ष्य से बचें. RBMB और शाही सेना माध्यमिक संरचना दोनों की भविष्यवाणियों ऐसे mfold 20 के रूप में सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. पूरक बंद लक्ष्य साइटों एक न्यूक्लियोटाइड बेसिक स्थानीय असाइनमेंट खोज उपकरण (ब्लास्ट) का उपयोग पहचान कर सकते हैं. हालांकि, क्योंकि मॉडल भविष्यवाणियों और प्रोटीन नीलामी साइटों की पहचान करने में कठिनाई में विसंगतियों की, सभी RBMBs की विशिष्टता अंततः प्रयोगात्मक सत्यापित किया जाना चाहिए.
वांछनीय है, संकरण राज्य के प्रति असंवेदनशील है कि एक unquenched संदर्भ डाई RBMB 15 में जोड़ा जा सकता है. एक संदर्भ डाई के अलावा जनसंपर्क कर सकते हैंजांच वितरण के लिए एक मार्कर ovide और कुल सेलुलर प्रतिदीप्ति की अधिक सटीक मापन के लिए आवश्यक हैं, तो ratiometric इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. संदर्भ रंगों माप वितरण में सेल करने वाली सेल विविधताओं के कारण पृष्ठभूमि में अंतर के लिए समायोजित करने की अनुमति देता है. हालांकि, व्यक्तिगत शाही सेना इमेजिंग जब संदर्भ डाई आवश्यक नहीं है देखिए. विशेष रूप से, कुछ संदर्भ रंगों नाभिक में एक से थोड़ा अधिक पृष्ठभूमि संकेत करने के लिए अग्रणी, नाभिक से RBMBs के निर्यात के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
अच्छी तरह से डिजाइन जब लक्ष्य शाही सेना में कम से कम चार RBMB बाध्यकारी साइटों (चित्रा 1 बी) 16 शामिल करने के लिए इंजीनियर है, तो RBMBs, एकल जीवित कोशिकाओं में छवि व्यक्तिगत शाही सेना टेप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. RBMBs कुशलतापूर्वक सेल व्यवहार्यता 21 पर कोई प्रभाव नहीं करने के लिए थोड़ा के साथ, microporation के माध्यम से कोशिकाओं प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में दिया जा सकता है, और जीन अभिव्यक्ति की मात्रात्मक माप किया जा सकता है30 मिनट के भीतर हासिल कर ली. अपार RBMBs से प्रतिदीप्ति कुशलता से बुझती है, क्योंकि इसके अलावा, कार्यप्रणाली, RBMB एकाग्रता और लक्ष्य शाही सेना के स्तर को काफी असंवेदनशील है. यहाँ हम RBMBs तैयार करने और शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया पद्धति का विस्तृत वर्णन है, साथ ही microporation के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में RBMBs के वितरण के लिए एक सामान्य प्रक्रिया है और वास्तविक समय में एक शाही सेना टेप के इमेजिंग प्रदान करते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक पारंपरिक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग जीवित कोशिकाओं में छवि एक इंजीनियर शाही सेना टेप करने की क्षमता प्रत्येक शाही सेना प्रतिलेख और अपार फ्लोरोसेंट जांच से निकलती एक कम फ्लोरोसेंट पृष्?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार (0953583) और स्वास्थ्य NCI / R21-CA116102 के राष्ट्रीय संस्थान, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Nuclease-free Water | Life Technologies | AM9932 | no DEPC-treated |
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | No Ca2+ and Mg2+ |
| Cary 100 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P284-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | S381-500 | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5mL |
| Chromatography Column | Kimble Chase Life Science | 420400-0720 | 0.7x20cm |
| Superdex 75 Prep Grade | GE healthcare | 17-1044-01 | |
| Syringe Pump | Braintree Scientific | BS-300 | |
| Syringe | BD | 301035 | 60mL, Luer-lok tip |
| Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC501096 | Mw 10,000 cutoff |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280-5MG | lyophilized powder, g-irradiated |
| 8-well chambered coverglass | Fisher Scientific | 155409 | Working volume 0.2-0.5mL |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | Human Fibrosarcoma cell line |
| Cell Culture Flask | Corning | 430639 | 25cm2 |
| DMEM | Life Technologies | 11965084 | High glucose |
| DMEM without Phenol Red | Life Technologies | 21063029 | High glucose |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Penecillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| Neon transfection system | Life Technologies | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Life Technologies | MPK1096 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 02-671-10 | |
| Hoescht 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| IX-81 Inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| SOLA light engine | Lumencor | ||
| Metamorph | Molecular Devices | Software controlling microscope | |
| Immersol oil 518F | Fisher Scientific | 12-624-66B |
Riferimenti
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
- Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
- Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
- Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
- Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
- Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
- Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
- Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
- Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
- Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
- Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
- Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
- Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148 (2010).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
- Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
- Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69 (2008).
- Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152 (2013).
- Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
- Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
- Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105 (2007).
- Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315 (2009).
- Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58 (2004).
- Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57 (2004).
- Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
- Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
- Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
- Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100 (2009).
- Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309 (2006).
