세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상
Summary
급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.
Abstract
급성 뇌 손상은 종종 다른 사고 머리 손상의 결과 및 인구의 상당 부분 영향을 미치지 만, 그것에 대한 효과적인 치료법은 아직 없다. 현재 사용되는 동물 모델의 제한은 병리 메커니즘에 대한 이해를 방해. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 생리적, 병리 적 조건에서 그대로 동물의 뇌 내에서 세포와 조직을 연구 할 수 있습니다. 여기서는 외상 조건 하에서 뇌 세포 행동의 이광자 촬상 의해 공부 급성 뇌 손상의 두 모델을 설명한다. 선택된 뇌 영역은 뇌 실질 조직의 제어 폭과 깊이의 외상을 생산하는 날카로운 바늘로 부상하고 있습니다. 우리의 방법은 동시 약 응용과 결합 될 수있는 주사기 바늘로 찌름 정위를 이용한다. 우리는이 방법은 포유류의 뇌에 급성 외상의 병태 생리 학적 결과의 세포 메커니즘을 연구하는 고급 도구로 사용될 수 있음을 제시한다 <em> 생체 내. 두개골 창 두개골 숱이 비디오에서는, 우리는 두 가지 준비를 급성 뇌 손상을 결합한다. 우리는 또한 외상 후 뇌 재생의 멀티 세션 이미징을위한 두 제제의 장점과 한계에 대해 설명합니다.
Introduction
급성 뇌 손상은 자동차 충돌에서 부상의 높은 발병률과 중요한 공중 보건 문제가 떨어지거나 공격, 이후 만성 장애의 높은 보급. 뇌 손상의 치료에 대한 치료 적 접근 따라서, 병원 전 수술 및 중환자 치료의 효과를 제한하는, 완전히 증상이 남아 있습니다. 이것은 뇌 손상의 사회 경제적 영향은 특히 심각합니다. 여러 가지 이유로, 임상 시험의 대부분은 새로운 치료 방법을 사용하여 뇌 손상 후 회복에 개선을 보여 못했습니다.
동물 모델은 약물 효능은 뇌 손상 환자에서 예상 할 수있는 무대를 향해 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 매우 중요합니다. 현재, 두부 외상의 몇 가지 잘 설립 된 동물 모델은 제어 대뇌 피질의 영향 1, 유체 타악기 부상 2, 동적 대뇌 피질의 변형 3, 체중 저하 등의 존재4, 그리고 사진 부상 5. 실험 모델의 숫자는 두부 외상 관련 병리의 특정 형태 학적, 분자 및 행동 양상을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, 하나의 동물 모델은 새로운 치료 전략을 검증하는 데 완전히 성공하지 않습니다. 뇌 손상, 신뢰성 및 재현성 제어 된 동물 모델의 개발은 복잡한 프로세스 병리학을 평가하기 위해 필요하다.
최신 현미경 이미징 기술과 유전자 인코딩 형광 기자의 신규 조합은 기본 상해, 차 상해, 및 재생의 확산, 차 상해를 포함 뇌 손상의 모든 단계를 조사 할 수있는 전례없는 기회를 제공합니다. 특히, 생체 이광자 현미경 설치류 뇌의 깊은 층의 피질 세포에서도 세포 내 구조물의 실시간 시각화를 허용하는 고유의 비선형 광학 기술이다. 세포와 ORGA 여러 종류의nelles 다른 형광 마커를 조합하여 동시에 영상화 할 수있다. 이 강력한 도구를 사용하여, 우리는 외상 후 조건에서 뇌 생활에 동적 인 형태 학적 및 기능적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 뇌 손상 연구에서 생체 내 두 광자 현미경의 장점은 최근 키로프와 동료 6에 의해 입증되었다. 마일드 초점 피질 타박상 모델을 사용하여, 이들 저자들은 pericontusional 피질 급성 돌기 부상이 로컬 혈류의 감소에 의해 게이트 된 것으로 나타났다. 또한, 그들은 타박상 사이트 주위의 대사 저하 피질이 더 확산 탈분극에 의해 손상되는 것을 보여 주었다. 이 차 손상이 외상성 뇌 손상의 결과가 더 심각하고, 시냅스 회로에 영향을 미칩니다.
여기, 우리는 지역의 두뇌를위한 고급 모델로, 동시 국소 약물의 응용 프로그램과 결합 될 수있는 주사기 바늘로 정위 찌르기의 방법을 제안한다상해 및 생체 내에서 포유 동물의 뇌에 급성 외상의 병태 생리 학적 결과를 연구 도구로.
Protocol
Representative Results
Discussion
뇌 손상은 갑작스러운, 예측할 수없는 이벤트입니다. 여기에서, 우리는 신경 변성, 수상 돌기의 제거, 뇌 부종, 아교 흉터, 초점 지주막 하 출혈과 함께 대뇌 피질의 출혈과 증가 투자율과 같은 뇌 손상 후에 인간의 환자에서 관찰 된 병리학 적 변화의 스펙트럼을 재현 동물 모델을 설명 혈액 – 뇌 장벽. 기본 및 보조 기전뿐만 아니라, 외상 후 회복을 연구하기 위해이 부상 모델은 미세 신경 세포와 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 GFAP-EGFP와 CX3CR1-EGFP 마우스 균주를 제공하는 프랭크 박사 키르히 호프에 깊이 감사드립니다. 작품은 핀란드의 국제 이동성 센터, Tekes, 핀란드의 신경 과학 대학원 (FGSN), 핀란드의 아카데미에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
Riferimenti
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
