טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית
Summary
טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.
Abstract
למרות טראומה מוחית חריפה לעתים קרובות תוצאות מנזק בראש בתאונות שונות ומשפיעה על חלק ניכר מהאוכלוסייה, אין טיפול יעיל לזה עדיין. מגבלות של מודלים של בעלי חיים המשמשים כיום לעכב הבנה של מנגנון פתולוגיה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד תאים ורקמות במוח של בעלי חיים ללא פגע אורכים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. כאן, אנו מתארים שני מודלים של פגיעה מוחית חריפה למדו באמצעות הדמיה שני פוטונים של תאים במוח התנהגות בתנאי פוסט טראומתיים. אזור במוח שנבחר הוא נפגע עם מחט חדה כדי לייצר טראומה של רוחב ועומק שבשליטת parenchyma המוח. השיטה שלנו משתמשת בזין stereotaxic עם מחט מזרק, אשר יכול להיות בשילוב עם יישום תרופה בו זמנית. אנו מציעים כי בשיטה זו יכולה לשמש ככלי מתקדם ללמוד מנגנונים תאיים של השלכות pathophysiological של טראומה חריפה במוח של יונקים <em> In vivo. בסרטון הזה, אנו משלבים פגיעה מוחית חריפה עם שתי הכנות: דילול חלון וגולגולת גולגולת. כמו כן נדונונו ביתרונות ומגבלות של שני ההכנות להדמית multisession של התחדשות המוח לאחר טראומה.
Introduction
פגיעה מוחית חריפה היא בעיה משמעותית בבריאות הציבור עם שכיחות גבוהה של פגיעה בתאונות דרכים, נפילות או תקיפות, ושכיחות גבוהה של מוגבלות כרוניות שלאחר מכן. גישות טיפוליות לטיפול בפגיעה מוחית יישארו סימפטומטי לחלוטין, ובכך להגביל את האפקטיביות של טיפול prehospital, כירורגית וקריטי. זה הופך את ההשפעה החברתית והכלכלית של פגיעה מוחית חמורה במיוחד. עבור מגוון רחב של סיבות, רוב הניסויים הקליניים לא הצליח להוכיח שיפור בהתאוששות לאחר פגיעה מוחית תוך שימוש בגישות טיפוליות חדשניות.
מודלים של בעלי החיים הם קריטיים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לקראת שלב שבו יעילות תרופה ניתן לחזות בחולים עם ניזק מוחי. נכון לעכשיו, כמה מודלים של בעלי חיים מבוססים היטב של חבלת הראש קיימים, כוללים השפעה מבוקרת קליפת המוח 1, פגיעת הקשה נוזל 2, עיוות בקליפת המוח דינמית 3, ירידה במשקל4, ופציעת תמונה 5. מספר המודלים הניסיוניים שנוצלו כדי ללמוד היבטים מורפולוגיים, מולקולריים והתנהגותיות מסוימים של פתולוגיה הקשורים חבלת הראש. עם זאת, אין מודל חיה אחת הוא מוצלח כולו באימות אסטרטגיות טיפוליות חדשות. פיתוח של מודלים של בעלי חיים אמינים, לשחזור ובשליטה של פגיעה מוחית יש צורך להעריך את התהליכים פתולוגיים המורכבים.
שילוב החדשני של הטכנולוגיות החדישות ביותר מיקרוסקופי ההדמיה וכתבי ניאון גנטי מקודדים מציע הזדמנות חסרת תקדים לחקור את כל השלבים של פגיעה מוחית, הכוללים פגיעה העיקרית, הפצה של הפגיעה העיקרית, פגיעה משנית, והתחדשות. בפרט, in vivo שני הפוטונים במיקרוסקופ הוא טכנולוגיה אופטית קוי ייחודית המאפשרת הדמיה של מבנים תאיים ואפילו subcellular בשכבות בקליפת המוח עמוקה של מוח מכרסם בזמן אמת. מספר סוגים של תאים וorgaניתן הדמיה Nelles בו זמנית על ידי שילוב סמני ניאון שונים. שימוש בכלי רב עוצמה זה, אנו יכולים לחזות שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים דינמיים בחיים מוח בתנאי פוסט טראומתיים. היתרונות של במיקרוסקופ שני פוטונים vivo בלימוד פגיעה מוחית הודגמו לאחרונה על ידי קירוב ועמיתיו 6. שימוש במודל חבלה קל המוקדים בקליפת המוח, מחברים אלה הראו כי פציעה הדנדריטים חריפה בקליפת pericontusional היא מגודרת על ידי הירידה בזרימת הדם המקומית. יתר על כן, הם הראו כי קליפת המוח נפגעת מטבולית סביב אתר חבלת ניזוק עוד יותר על ידי שלילת קוטביות מתפשטת. נזק המשני זה משפיע על מעגלים סינפטיים, מה שהופך את ההשלכות של פגיעה מוחית טראומטית חמורות יותר.
כאן, אנו מציעים את השיטה של זין stereotaxic עם מחט מזרק, אשר יכול להיות בשילוב עם יישום תרופה אקטואלי בו זמנית, כמודל מתקדם למוח המקומיפציעה וככלי ללמוד השלכות pathophysiological של טראומה חריפה במוח של היונקים in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
טראומה מוחית היא אירוע פתאומי, בלתי צפוי. כאן, אנו מתארים את מודל החיה שמתרבה ספקטרום של שינויים פתולוגיים שנצפו בחולים אנושיים לאחר פגיעה מוחית כגון ניוון מוחיים, חיסול של דנדריטים, בצקת במוח, צלקת גליה, דימומים בקליפת המוח בשילוב עם דימום תת עכבישי מוקד וחדירות מוגב…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לד"ר פרנק קירכהוף למתן GFAP-EGFP וזני עכבר CX3CR1-EGFP. העבודה נתמכה על ידי מענקים ממרכז ניידות הבינלאומית של פינלנד, טקס, בית הספר פיני בוגר מדעי המוח (FGSN) והאקדמיה של פינלנד.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
Riferimenti
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
