縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷
Summary
急性脳外傷は現在まで適切な治療を持っていない重傷です。多光子顕微鏡は、縦方向に急性脳外傷開発のプロセスを研究し、げっ歯類における治療的戦略をプロービングできます。脳のin vivo二光子イメージングに師事急性脳外傷の二つのモデルは、このプロトコルで実証されています。
Abstract
急性脳外傷は多くの場合、異なる事故頭部損傷に起因して、人口のかなりの部分に影響を与えますが、そのための有効な治療法がありません。現在使用されている動物モデルの制限は、病理メカニズムの理解を妨げる。多光子顕微鏡は、長手方向の生理学的および病理学的条件の下で、無傷の動物の脳内の細胞や組織を研究できます。ここでは、外傷後の条件下で脳細胞挙動の二光子イメージングによって研究急性脳損傷の2つのモデルを記載している。選択された脳領域は、脳実質内の制御幅と深さの外傷を生成するために鋭利な針でけがをされている。我々の方法は、同時薬物アプリケーションと組み合わせることができ、注射針で刺す定位を使用しています。我々は、この方法は、哺乳動物の脳における急性の外傷の病態生理学的影響の細胞機構を研究するための高度なツールとして使用することができることを提案する<em>生体内で。頭蓋窓や頭蓋骨間伐：このビデオでは、我々は2製剤による急性脳損傷を兼ね備えています。我々はまた、外傷後の脳再生のマルチセッションイメージングのための両方の製剤の利点と制限について説明します。
Introduction
急性脳損傷は、自動車のクラッシュにおける損傷の高い発生率と有意な公衆衛生問題である落下又は暴行、およびその後の慢性障害の有病率が高い。脳損傷の治療に対する治療的アプローチは、このように、病院前の手術や救命医療の有効性を制限する、完全に症候性のまま。これは脳損傷の社会的·経済的影響が特に深刻になる。様々な理由のために、臨床試験のほとんどは、新規な治療アプローチを使用して脳損傷後の回復の改善を示すことができなかった。
動物モデルは、薬効が脳損傷を有する患者において予測することができるステージに向けて新たな治療戦略を開発するために重要である。現時点では、頭部外傷のいくつかの十分に確立された動物モデルは、制御された皮質衝撃1は、流体パーカッション傷害2、動的変形皮質3、体重低下を含む、存在する4とフォト損傷5。実験モデルの数は、頭部外傷に関連した病理学の特定の形態学、分子生物学および行動の側面を研究するために使用されてきた。しかし、単一の動物モデルは、新たな治療戦略の検証において完全に成功していない。脳損傷の、信頼性の高い再現性及び制御された動物モデルの開発は、複雑な病理学的プロセスを評価する必要がある。
最新の顕微鏡イメージング技術と遺伝的に符号化された蛍光レポーターの新規な組み合わせは、一次損傷、二次的損傷、および再生の広がり、原発傷害を含む脳損傷のすべてのフェーズを、調査する前例のない機会を提供しています。具体的には、in vivoでの 2光子顕微鏡は、げっ歯類の脳の深部皮質層の細胞でも細胞内構造をリアルタイムに可視化を可能にする独自の非線形光学技術です。細胞やORGAにはいくつかの種類Nelles社は、異なる蛍光マーカーを組み合わせることによって同時に撮像することができる。この強力なツールを使用して、我々は外傷後の条件での脳の生活の動的な形態学的および機能的変化を視覚化することができます。脳損傷の研究にin vivoでの 2光子顕微鏡の利点は、最近キーロフと同僚6によって実証された。軽度の焦点皮質挫傷モデルを使用して、これらの著者は、pericontusional皮質の急性樹状損傷がローカルの血流の減少によりゲート制御されることを示した。さらに、それらは挫傷部位の周囲の代謝的に損なわ皮質をさらに脱分極拡散によって損傷されることを実証した。この二次的な損傷は、外傷性脳損傷の影響がより深刻なこと、シナプス回路に影響を与えます。
ここでは、地元の頭脳のための高度なモデルとして、同時局所薬物のアプリケーションと組み合わせることができる注射針で刺す定位の方法を提案する傷害およびin vivoで哺乳動物の脳内の急性外傷の病態生理学的影響を研究するためのツールとして。
Protocol
Representative Results
Discussion
脳外傷は突然の、予期できないイベントです。ここでは、このような神経変性、樹状突起の除去、脳浮腫、グリア性瘢痕、焦点くも膜下出血との透過性の増大と相まって、大脳皮質内の出血などの脳損傷後のヒト患者で観察病理学的変化のスペクトルを再現する動物モデルを記述する血液脳関門。プライマリとセカンダリの病因を研究だけでなく、外傷後の回復には、この損傷モデルは、細?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、GFAP-EGFPおよびCX3CR1-EGFPマウス系統を提供するための博士フランクキルヒホッフに深く感謝しています。作品は、フィンランドの国際的な流動のセンター、技術庁、神経科学のフィンランド大学院（FGSN）、フィンランドアカデミーからの補助金によって支えられている。
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
Riferimenti
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
