Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem
Summary
Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.
Abstract
Embora trauma cerebral aguda muitas vezes resulta de danos à cabeça em diferentes acidentes e afeta uma fração substancial da população, não existe um tratamento eficaz para ele ainda. Limitações dos modelos animais usados atualmente impedem a compreensão do mecanismo de patologia. Microscopia Multiphoton permite o estudo de células e tecidos dentro cérebros de animais intactos longitudinalmente sob condições fisiológicas e patológicas. Aqui, descrevemos dois modelos de lesão cerebral aguda estudados por meio de dois fótons de imagem de comportamento das células do cérebro em condições pós-traumáticas. A região do cérebro selecionado é ferido com uma agulha fina para produzir um trauma de largura controlada e profundidade no parênquima cerebral. O nosso método utiliza estereotáxico picada com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação simultânea de drogas. Propomos que este método pode ser utilizado como uma ferramenta avançada para estudar os mecanismos celulares de consequências fisiopatológicos de traumas agudos no cérebro dos mamíferos <em> In vivo. Neste vídeo, nós combinamos lesão cerebral aguda com duas preparações: cranial janela e crânio de desbaste. Discutimos, também, vantagens e limitações de ambos os preparativos para várias sessões de imagem de regeneração cerebral após trauma.
Introduction
Lesão cerebral aguda é um problema significativo de saúde pública, com alta incidência de lesões em acidentes de trânsito, quedas ou agressões, e alta prevalência de incapacidade crônica subseqüente. As abordagens terapêuticas para o tratamento de lesões cerebrais permanecem totalmente sintomático, limitando assim a eficácia do atendimento pré-hospitalar, cirúrgico e crítico. Isso faz com que o impacto social e econômico da lesão cerebral particularmente grave. Por uma variedade de razões, a maioria dos ensaios clínicos não demonstraram melhoria na recuperação após a lesão cerebral usando novas abordagens terapêuticas.
Os modelos animais são cruciais para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para uma fase em que a eficácia da droga pode ser previsto em pacientes com lesões cerebrais. Atualmente, existem vários modelos animais bem estabelecidos de traumatismo craniano, incluindo o impacto controlado cortical 1, o fluido lesão percussão 2, dinâmico deformação cortical 3, peso-drop4 e lesão foto 5. Uma série de modelos experimentais têm sido utilizados para estudar certos aspectos morfológicos, moleculares e comportamentais de cabeça associada a trauma patologia. No entanto, nenhum modelo animal único é totalmente bem-sucedido na validação de novas estratégias terapêuticas. Desenvolvimento de modelos animais confiáveis, reprodutíveis e controladas de lesão cerebral é necessário avaliar os processos patológicos complexos.
A nova combinação das mais recentes tecnologias de imagem microscópica e repórteres fluorescentes geneticamente codificados oferece uma oportunidade sem precedentes para investigar todas as fases da lesão cerebral, que incluem lesão primária, espalhando-se da lesão primária, a lesão secundária e regeneração. Em particular, in vivo microscopia de dois fótons é uma tecnologia óptica não-linear única que permite a visualização em tempo real das estruturas celulares e subcelulares mesmo em profundas camadas corticais do cérebro de roedores. Vários tipos de células e organelles podem ser visualizados simultaneamente, combinando diferentes marcadores fluorescentes. Usando essa poderosa ferramenta, podemos visualizar as alterações morfológicas e funcionais dinâmicos no cérebro vivendo sob condições pós-traumáticas. As vantagens da microscopia in vivo de dois fótons em estudar lesão cerebral foram recentemente demonstrado pelo Kirov e colegas 6. Usando um modelo de contusão cortical focal leve, estes autores mostraram que a lesão dendrítica aguda no córtex pericontusional é fechado pela diminuição do fluxo sanguíneo local. Além disso, demonstraram que o córtex metabolicamente comprometida em torno do local contusão é mais danificado pela despolarização espalhar. Este dano secundário afeta circuitos sinápticos, tornando as conseqüências da lesão cerebral traumática mais grave.
Aqui, propõe-se o método de picada estereotáxico com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação tópica de drogas em simultâneo, como um modelo avançado para o local do cérebrolesão e como uma ferramenta para estudar as consequências fisiopatológicas do trauma agudo no cérebro de mamíferos in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trauma cerebral é um evento abrupto, imprevisível. Aqui, nós descrevemos o modelo animal que reproduz um espectro de alterações patológicas observadas em pacientes humanos após a lesão do cérebro, tais como a neurodegeneração, a eliminação de dendritos, edema cerebral, cicatriz glial, hemorragias no córtex cerebral, juntamente com uma hemorragia subaracnóide focal e aumento da permeabilidade da barreira sangue-cérebro. Estudar patogênese primário e secundário, bem como a recuperação após o trauma, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos profundamente agradecidos ao Dr. Frank Kirchhoff para a prestação de GFAP-EGFP e cepas CX3CR1-EGFP do mouse. O trabalho foi suportado por concessões do Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, Tekes, o finlandês Graduate School of Neuroscience (FGSN) e da Academia da Finlândia.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
Riferimenti
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