Острая травма мозга у мышей с последующим продольного двухфотонного изображений
Summary
Острая травма мозга является тяжелая травма, которая не имеет адекватного лечения на сегодняшний день. Многофотонная микроскопия позволяет изучать продольно процесс острого развития мозга при травмах и зондирования терапевтические стратегии у грызунов. Две модели острой травмы мозга учился с в естественных условиях двухфотонного визуализации мозга показали в этом протоколе.
Abstract
Хотя острая травма мозга часто является результатом повреждения головы в различных аварий и затрагивает значительную часть населения, не существует эффективного лечения для нее еще. Ограничения используемых в настоящее время моделях животных препятствуют пониманию механизма патологии. Многофотонная микроскопия позволяет изучать клетки и ткани в пределах неповрежденных мозгах животных продольно в физиологических и патологических состояниях. Здесь мы описываем две модели острой черепно-мозговой травмой, изучаемая с помощью двухфотонного визуализации поведения клеток мозга под посттравматических условиях. Выбран регион мозг травмирован с острой иглой для получения травму контролируемой шириной и глубиной в паренхимы мозга. Наш метод использует стереотаксической укол иглой шприца, который может быть в сочетании с одновременным применением наркотиков. Мы полагаем, что этот метод может быть использован как усовершенствованный инструмент для исследования клеточные механизмы патофизиологических последствий острой травмы в мозге млекопитающих <em> В естественных условиях. В этом видео, мы объединяем острой черепно-мозговой травмой с двумя препаратами: черепно окна и череп тоньше. Мы также обсудим преимущества и недостатки обоих препаратов для многосессионном визуализации регенерации мозга после травмы.
Introduction
Острая черепно-мозговая травма является серьезной проблемой общественного здравоохранения с высоким уровнем травмы в дорожно-транспортных происшествий, падений или нападения, и высокая распространенность последующей хронической инвалидности. Терапевтические подходы к лечению черепно-мозговой травмы остаются полностью симптоматическое, что ограничивает эффективность догоспитальном, хирургического и реанимационного. Это делает социальные и экономические последствия черепно-мозговой травмы, особенно тяжелой. По разным причинам, большинство клинических испытаний не смогли продемонстрировать улучшение восстановления после травмы головного мозга с использованием новых терапевтических подходов.
Животные модели имеют решающее значение для разработки новых терапевтических стратегий к той стадии, когда эффективность препарата может быть предсказано у больных с черепно-мозговыми травмами. В настоящее время несколько хорошо организованной животные модели травмы головы существуют, в том числе управляемой корковой воздействия 1, жидкости ударных травмы 2, динамической корковой деформации 3, вес-капли4 и 5 фото травмы. Ряд экспериментальных моделях были использованы для изучения некоторых морфологических, молекулярные и поведенческие аспекты травмы головы связанных патологии. Тем не менее, ни одна модель животное не удалось в полной оценки новых терапевтических стратегий. Разработка надежных, воспроизводимых и контролируемых животных моделях черепно-мозговой травмой необходимо оценить сложные патологические процессы.
Роман сочетание новейших микроскопических технологии визуализации и генетически закодированных люминесцентных журналистами предлагает беспрецедентную возможность изучить все этапы мозговой травмы, которые включают основную травмы, распространение первичной травмы, вторичного повреждения и регенерации. В частности, в естественных условиях двухфотонного микроскопия является уникальным нелинейный оптический технология, которая позволяет в режиме реального времени визуализации клеточных и субклеточных структур даже в глубоких слоях коры мозга грызунов. Несколько типов клеток и оргаNelles могут быть отображены одновременно, комбинируя различные флуоресцентные маркеры. С помощью этого мощного инструмента, мы можем представить себе динамические морфологические и функциональные изменения в живой мозг под посттравматических условиях. Преимущества в естественных условиях двухфотонного микроскопии в изучении травму головного мозга были недавно продемонстрировано Кирова и коллег 6. Использование мягкий фокусное корковой модель ушиб, эти авторы показали, что острая дендритных травмы в pericontusional коры закрытого в связи с сокращением местного кровотока. Кроме того, они показали, что метаболически нарушена кора вокруг ушиба сайта дополнительно повреждены в результате распространения деполяризации. Это вторичное повреждение влияет синаптическую схемы, что делает последствия черепно-мозговой травмы более серьезными.
Здесь мы предлагаем метод стереотаксической укола иглой шприца, который может быть в сочетании с одновременным местного применения наркотиков, как передовые модели для местного мозгатравмы и в качестве инструмента для изучения патофизиологических последствий острой травмы в мозге млекопитающих в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мозг травмы является неожиданным, непредсказуемым событием. Здесь мы опишем животную модель, которая воспроизводит спектр патологических изменений, наблюдаемых у больных людей после черепно-мозговой травмы, такие как нейродегенеративные, устранение дендритов, отек головного мозга, ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы глубоко благодарны д-р Франк Кирхгофа для обеспечения GFAP-EGFP и штаммов CX3CR1-EGFP мыши. Работа выполнена при поддержке грантов от центра международной мобильности Финляндии, Tekes, финская Высшей школы неврологии (FGSN) и Академией Финляндии.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
Riferimenti
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
