Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes
Summary
Trauma cerebral aguda es una lesión grave que no tiene un tratamiento adecuado hasta la fecha. Multiphoton microscopía permite estudiar longitudinalmente el proceso de desarrollo trauma cerebral agudo y en la exploración de estrategias terapéuticas en los roedores. Dos modelos de trauma cerebral agudo estudiado con imágenes in vivo de dos fotones de cerebro se demuestran en este protocolo.
Abstract
Aunque el trauma cerebral aguda a menudo resulta de daño cabeza en diferentes accidentes y afecta a una fracción sustancial de la población, no existe un tratamiento eficaz para la que todavía. Limitaciones de modelos animales utilizados actualmente impiden la comprensión del mecanismo de patología. Multiphoton microscopía permite estudiar las células y los tejidos dentro de los cerebros animales intactos longitudinalmente en condiciones fisiológicas y patológicas. A continuación, describimos dos modelos de lesión cerebral aguda estudiados por medio de dos fotones de imágenes de la conducta de las células cerebrales en condiciones postraumáticas. Una región del cerebro seleccionado se lesiona con una aguja para producir un trauma de una anchura controlada y la profundidad en el parénquima cerebral. Nuestro método utiliza pinchazo estereotáxica con una aguja de jeringa, que se puede combinar con la aplicación del fármaco simultánea. Proponemos que este método se puede utilizar como una herramienta avanzada para estudiar los mecanismos celulares de consecuencias fisiopatológicas de trauma agudo en cerebro de los mamíferos <em> In vivo. En este video, combinamos la lesión cerebral aguda con dos preparaciones: craneal ventana y el cráneo de adelgazamiento. También se discuten las ventajas y limitaciones de ambas preparaciones para imágenes multisesión de la regeneración del cerebro después de un traumatismo.
Introduction
Lesión cerebral aguda es un problema de salud pública con una alta incidencia de lesiones en accidentes automovilísticos, caídas o agresiones, y la alta prevalencia de la discapacidad crónica posterior. Enfoques terapéuticos para el tratamiento de la lesión cerebral permanecen totalmente sintomático, lo que limita la eficacia de la atención pre-hospitalaria, quirúrgica y crítica. Esto hace que el impacto social y económico de la lesión cerebral particularmente grave. Por una variedad de razones, la mayoría de los ensayos clínicos no han demostrado mejora en la recuperación después de la lesión cerebral utilizando nuevos enfoques terapéuticos.
Los modelos animales son cruciales para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas hacia una etapa en que la eficacia del medicamento se puede predecir en los pacientes con lesiones cerebrales. En la actualidad, existen varios modelos animales bien establecidos de trauma en la cabeza, incluyendo el impacto controlado cortical 1, lesión de percusión de fluido 2, la deformación cortical dinámico 3, peso-drop4, y la lesión foto 5. Un número de modelos experimentales se han utilizado para estudiar algunos aspectos morfológicos, moleculares y de comportamiento de la patología asociada con el trauma de cabeza. Sin embargo, ningún modelo animal único es un éxito completo en la validación de nuevas estrategias terapéuticas. Desarrollo de modelos confiables, reproducibles y controlados animales de lesión cerebral, es necesario evaluar los procesos patológicos complejos.
La nueva combinación de las últimas tecnologías de la imagen microscópica y reporteros fluorescentes genéticamente codificados ofrece una oportunidad sin precedentes para investigar todas las fases de la lesión cerebral, que incluyen la lesión primaria, extensión de la lesión primaria, lesión secundaria, y la regeneración. En particular, microscopía in vivo de dos fotones es una tecnología óptica no lineal único que permite la visualización en tiempo real de las estructuras celulares y subcelulares incluso en profundas capas corticales del cerebro de roedores. Varios tipos de células y OrgaNelles se pueden obtener imágenes de forma simultánea mediante la combinación de diferentes marcadores fluorescentes. El uso de esta potente herramienta, podemos visualizar cambios morfológicos y funcionales dinámicos en el cerebro que vive en condiciones postraumáticas. Las ventajas de la in vivo microscopía de dos fotones en el estudio de la lesión cerebral se demostraron recientemente por Kirov y colegas 6. Utilizando un modelo de contusión cortical focal leve, estos autores demostraron que la lesión aguda dendríticas en la corteza pericontusional es cerrada por la disminución en el flujo sanguíneo local. Por otra parte, demostraron que la corteza metabólicamente comprometido alrededor del sitio de contusión está dañado aún más por la despolarización de la difusión. Este daño secundario afecta circuitos sinápticos, haciendo que las consecuencias de la lesión cerebral traumática más severa.
Aquí, se propone el método de punción estereotáxica con una aguja de jeringa, que podría combinarse con la aplicación tópica del fármaco simultánea, como un modelo avanzado de cerebro locallesiones y como una herramienta para estudiar las consecuencias fisiopatológicas de trauma agudo en el cerebro de mamíferos in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traumatismo cerebral es un acontecimiento imprevisible abrupto. Aquí, se describe el modelo animal que reproduce un espectro de cambios patológicos observados en pacientes humanos después de la lesión cerebral, tales como la neurodegeneración, la eliminación de las dendritas, edema cerebral, cicatriz glial, hemorragias en la corteza cerebral, junto con una hemorragia subaracnoidea focal y aumento de la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro. Para estudiar la patogénesis primaria y secundaria, así como la rec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos profundamente agradecidos con el Dr. Frank Kirchhoff para proporcionar GFAP-EGFP y cepas de ratón CX3CR1-EGFP. El trabajo fue apoyado por becas del Centro de Movilidad Internacional de Finlandia, Tekes, finlandés Graduate School of Neuroscience (FGSN) y la Academia de Finlandia.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
Riferimenti
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