Boyuna İki foton görüntüleme ile takip Farelerde Akut Beyin Travma
Summary
Akut beyin travması bugüne kadar yeterli bir tedavisi olmayan ciddi bir yaralanma olduğunu. Multiphoton mikroskopi uzunlamasına akut beyin travması gelişim sürecini inceleyerek ve kemirgenlerde terapötik stratejiler sondalama sağlar. Beynin in vivo iki foton görüntüleme ile incelenmiştir akut beyin travması iki model bu protokolde gösterilmiştir.
Abstract
Akut beyin travması genellikle farklı kazalarında baş hasar sonuçları ve nüfusun önemli bir kısmını etkiler de, bunun için etkin bir tedavisi henüz yoktur. Şu anda kullanılan hayvan modellerinin Sınırlamalar patoloji mekanizmasının anlaşılmasını engellemektedir. Multiphoton mikroskopi uzunlamasına fizyolojik ve patolojik koşullar altında sağlam hayvan beyin içinde hücreleri ve dokuları inceleyerek sağlar. Burada, biz posttravmatik koşullar altında beyin hücre davranışı iki foton görüntüleme ile incelenmiştir akut beyin hasarı iki model tarif. Seçilen bir beyin bölgesi beyin parankiminde kontrollü bir genişlik ve derinlikte bir travma üretmek için keskin bir iğne ile yaralandı. Önerilen yöntem, aynı anda, ilaç uygulaması ile kombine edilebilir bir şırınga iğnesi ile stereotaksik dikmek kullanır. Bu yöntem, memeli beyin, akut travma patofizyolojik hücresel mekanizmaları incelemek için bir gelişmiş araç olarak kullanılabilir öneriyoruz <em> In vivo. Kafa penceresi ve kafatası inceltme: Bu videoda, biz iki hazırlıkları ile akut beyin hasarı birleştirir. Biz de travma sonrası beyin rejenerasyon çok oturumlu görüntüleme için hem de hazırlıklar avantajları ve sınırlamaları tartışmak.
Introduction
Akut beyin hasarı, motorlu araç kazalarında yaralanma insidansı yüksek olan önemli bir halk sağlığı sorunudur düşer ya da saldırılar ve müteakip kronik sakatlık yüksek yaygınlık. Beyin hasarının tedavisine terapötik yaklaşımlar, böylece, hastane öncesi cerrahi ve yoğun bakım etkililiğini sınırlayan, tamamen semptomatik kalır. Bu beyin hasarı, sosyal ve ekonomik etkisi özellikle şiddetli hale getirir. Çeşitli nedenlerle için, klinik çalışmaların en yeni tedavi yaklaşımları kullanarak beyin hasarı sonrası iyileşme iyileşme göstermek için başarısız oldu.
Hayvan modelleri ilaç etkinliği beyin hasarı olan hastalarda tahmin edilebilir bir aşamaya yönelik yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için çok önemlidir. Şu anda, kafa travması birkaç iyi kurulmuş hayvan modelleri kontrollü kortikal etkisi 1, sıvı perküsyon yaralanma 2, dinamik kortikal deformasyon 3, ağırlık düşmesi gibi, mevcut4, ve fotoğraf yaralanma 5. Deneysel modellerin bir dizi kafa travması ile ilişkili patoloji bazı morfolojik, moleküler ve davranışsal yönlerini incelemek için kullanılır olmuştur. Ancak, tek bir hayvan modeli, yeni tedavi stratejileri doğrulayarak tamamen başarılıdır. Beyin hasarı, güvenilir, tekrar üretilebilir ve kontrollü hayvan modellerinin geliştirilmesi karmaşık patolojik durumun değerlendirilmesi için gereklidir.
Son mikroskopik görüntüleme teknolojileri ve genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere yeni kombinasyonu birincil yaralanma, ikincil yaralanma ve rejenerasyon yayılması, birincil travması beyin hasarı tüm aşamalarını, araştırmak için benzersiz bir fırsat sunuyor. Özel olarak, in vivo iki foton mikroskopi kemirgen beyin derin katmanlarında kortikal hücre ve hatta hücre içi yapıların gerçek zamanlı görselleştirme sağlayan eşsiz bir doğrusal olmayan optik bir teknolojidir. Hücre ve organizasyonu çeşitli türleriNelles farklı floresan belirteçleri birleştirerek aynı anda görüntülü olabilir. Bu güçlü aracını kullanarak, posttravmatik koşullar altında beyin yaşayan dinamik morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler oluşturulabiliyor. Beyin hasarı okuyan in vivo iki foton mikroskopi avantajları son zamanlarda Kirov ve meslektaşları 6 tarafından gösterildi. Hafif fokal kortikal kontüzyon modeli kullanılarak, bu yazarlar pericontusional kortekste akut dendritik yaralanma lokal kan akışında düşüş kapılı olduğunu gösterdi. Ayrıca, çürük site çevresinde metabolik tehlikeye korteks daha da yayılmasını depolarizasyon hasar olduğunu gösterdi. Bu ikincil hasar travmatik beyin hasarının sonuçları daha şiddetli hale sinaptik devreyi etkiler.
Burada, lokal beyin için gelişmiş bir model olarak eş zamanlı, topikal ilaç uygulamasıyla kombine edilebilir bir şırınga iğnesi ile stereotaksik dikmek bir yöntem önerilmektediryaralanması ve in vivo memeli beyninde akut travma patofizyolojik sonuçlarını incelemek için bir araç olarak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beyin travması ani, öngörülemeyen bir olay. Burada, örneğin nörodejenerasyon, dendrit eliminasyonu, beyin ödemi, glial yara izi, fokal subaraknoid kanama ile birleştiğinde serebral korteks kanamalar ve artan geçirgenliği gibi beyin hasarı sonrası insan hastalarda gözlenen patolojik değişikliklerin bir spektrumunu üretir hayvan modeli tanımlamak Kan-beyin bariyeri. Birincil ve ikincil patogenezi yanı sıra, travma sonrası iyileşme incelemek için, bu yaralanma modeli iyi nöronal ve glial yapıları…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz GAFP-EGFP ve CX3CR1-EGFP fare suşları sağlamak için Dr Frank Kirchhoff derinden müteşekkiriz. Iş Finlandiya Uluslararası Hareketlilik Merkezi, Tekes, Neuroscience Fin Enstitüsü (FGSN) ve Finlandiya Akademisi hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 2A-sa dumb Tweezers, 115mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30G ½’’ needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10X | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eyes-ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 microliter | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5×5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
Riferimenti
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L. Experimental studies in head injury. Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
