배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영
Summary
여기, 우리는 저산소증에 HIF1A – 매개 세포 반응의 새로운 유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 규제를 식별 할 수있는 대상의 siRNA "ubiquitome"화면을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기자 활동 중 강력한 읽기가 사용할 수있는 모든 생물학적 경로에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 분자 (UBLs)와 단백질의 번역 후 변형은 저산소증 응답, proteostasis, DNA 손상 반응 및 전사 등 다양한 생물 학적 경로를 조절하는 동적 인 세포 신호 전달 네트워크로 부상하고있다. 더 나은 UBLs이 인간의 질병에 관련된 경로를 조절하는 방법을 이해하기 위해, 우리는 인간의 siRNA를 컴파일 "ubiquitome"모든 알려진 UBL 시스템 경로의 구성 요소를 예측을 대상으로 1,186 siRNA의 이중 풀로 구성된 라이브러리입니다. 이 라이브러리는 UBL 성분은 당해 통로의 포지티브 또는 네거티브 레귤레이터 역할 결정하는 다양한 생물학적 경로의 기자 발현 세포주의 범위에 대해 스크리닝 할 수있다. 여기에서, 우리는 전사 기반의 루시 페라 제 기자를 사용하여 저산소증에 HIF1A – 매개 세포 반응의 ubiquitome – 레귤레이터를 식별하기 위해이 라이브러리를 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 초기 분석 개발 단계1 차, 2 차 및 3 차 / 컨볼 루션 스크리닝 : 세 단계로 화면을 수행하기 전에 세포주의 선별 적합한 매개 변수를 설정하기 위해 수행된다. 그것은 단지 조사가 가장 관심있는 통로의 구성원에 대한보고의 이점을 제공으로 전체 게놈의 siRNA 라이브러리를 통해 대상의 사용은 점점 더 인기를 끌고있다. siRNA의 심사의 본질적인 한계에도 불구하고, 특히 가양는 siRNA를 표적 이탈 효과로 인한 문제의 경로의 진정한 새로운 규제의 식별은주의 깊게 수행 제어 일련의 실험을 수행함으로써 극복 할 수있다 이러한 단점을보다 큽니다.
Introduction
유비퀴틴과 유비퀴틴 같은 분자 (UBLs)와 단백질의 변형은 다양한 생물 학적 경로와 스트레스 반응을 조절하는 광대 한 생화학 시스템을 나타냅니다. 타겟 단백질에 UBLs의 공유 결합은 안정성, 현지화, 기능 또는 기판 (1)의 interactome를 조절하는 다양한 결과를 가질 수 있습니다. UBL 수정의 기초가되는 효소 단계는 첫 번째 유비퀴틴 설립, 지금 SUMO, NEDD8, ISG15 및 FAT10를 포함한 대부분의 UBLs와 수정을위한 패러다임의 역할을 하였다. 수정이 발생하는 경우, UBL의 diglycine 모티프의 카르 복실 그룹은 제 E2 컨쥬 효소의 활성 사이트에 전송된다 시스테인 고 에너지 티올을 형성하기 위해 E1 활성화 효소에 의해 활성화된다. E2는 (보통) 측쇄 (isopeptide)을 생성 대상 라이신 잔기가 결합이 상 UBL의 이동을 중재하는 기판 – 결합 E3 리가 아제와 상호 작용. 수정의 연속 라운드 선형 유비퀴틴 체인을 만들 유비퀴틴을위한 일곱 라이신의를 통해 발생할 수있는 기판 상에 또는 N-말단 메티오닌을 통해 isopeptide 체인을 구축하기 위해 발생할 수 있습니다. 이러한 수정은 이전의 전문 단백질 분해 효소에 의해 UBL 제거에 새로운 상호 작용 모티브를 생성하고 분해를 위해 단백질을 대상으로 다양한 목적으로 별도의 토폴로지를 형성한다. 유비퀴틴의 경우 두 개의 E1 효소, 30 ~ 40 E2 활용시키는 효소, 적어도 600 E3 ligase라는 약 100 deubiquitylating 효소 (더빙)가있다. 경로가 다른 10 정도 UBLs 덜 팽창 동안, 전반적인 ubiquitome 복잡성은 특정 UBL 개질 생물학적 결과에 큰 다양성을 제공한다. UBL 생물학의 주요 발전하였으나 그러나, 이러한 ubiquitome 구성 요소의 대부분의 정확한 세포의 역할은 잘 알려져 있지 않은 상태이다.
짧은 INT의 사용erfering 리보 핵산 (siRNA를)은 개별 유전자의 역할은 다른 생물 학적 맥락 3에서 조사 할 수 있도록 구체적으로 인해 파괴 세포의 mRNA를 표적으로하는 siRNA를의 능력에 역 유전학의 강력한 도구로 떠오르고있다. 전체 게놈 화면은 많은 세포 과정의 새로운 규제를 확인하고 유효성을 검사하는 데 사용되었으며, 넓은 과학 사회에 접근 할 유용한 데이터의 재산을 만들었습니다. 전체 게놈 스크린은 매우 유용 입증하면서 그러나, 대상 화면들이 저렴 점점 인기를 끌고있다, 빨리 만 조사가 가장 관심있는 게놈의 구성원에 더 적은 데이터 관리 및보고를 포함한다. 따라서, 더 나은 세포 프로세스 UBL 가족 구성 요소에 관여하는 이해하기 위해, 우리는 모든 알려진 ubiquitome의 구성 요소를 예측을 대상으로하는 인간의 siRNA 라이브러리를 컴파일합니다. 이것은 UBLs, E1 활성화 효소, E2의 공액을 포함효소, E3의 리가 제, 유비퀴틴 결합 도메인 (UBD) 함유 단백질과 더빙. 이 라이브러리는 그러므로 이러한 경로를 지배하는 신규 UBL 성분의 공정한 식별을 허용 별개 생물학적 문제 리포터 세포주의 넓은 범위에 대하여 스크린 할 수있다.
다음 프로토콜은 엄격한 대상의 siRNA에게 저산소증에 HIF1A 의존 반응의 새로운 규제를 식별 할 수 ubiquitome 화면을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 정상 산소 분압에서 HIF1A는 폰 Hippel 린다 우 (VHL) E3 리가 단지 4 인식하고 분해 대상이됩니다 프 롤릴 수산화이 적용됩니다. 저산소증은 HIF1A의 안정화로 이어지는 프 롤릴 하이드 록을 억제하고 그 이후의 저산소증 반응 요소 (HRES)에 결합하는 유전자 발현을 구동 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 안정적 하이록 세 탠덤 복사본 제어 하에서 반딧불 루시퍼 라제를 발현 U20S 골육종 세포를 사용하여 화면을 설명poxia 응답 요소 (HRE U20S-세포) 5. 리포터 활성의 강력한 판독이 달성 적절한 양성 및 음성 대조군으로 결합 할 수있는 경우이 프로토콜은 모든 생물학적 경로에 대해 적응 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
포유 동물 세포의 게놈 전체의 siRNA 스크린의 사용은 별개의 생물 학적 경로의 새로운 규제를 식별하는 매우 가치있는 것으로 입증되었습니다. 여기서, 우리는 저산소증 HIF1A – 매개 세포 반응의 레귤레이터를 식별하기 위해 타겟 ubiquitome의 siRNA를 화면의 사용을 설명했다. 그들은 일반적으로 저렴 빠르고, 쉽게 관리 할 수 만 수사관 7, 10, 11, 관심있는 통로의 구성 요소에 대한 보고서입니?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust), 글락소 스미스 클라인 (GSK)과 세포 신호 전달을위한 스코틀랜드 연구소 (MRC 단백질 인산화 및 Ubiquitylation 단위의 지금 부분)에 의해 지원되었다.
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
Riferimenti
- Hochstrasser, M. Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature. 458, 422-429 (2009).
- Schulman, B. A., Harper, J. W. Ubiquitin-like protein activation by E1 enzymes: the apex for downstream signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 319-331 (2009).
- Siomi, H., Siomi, M. C. On the road to reading the RNA-interference code. Nature. 457, 396-404 (2009).
- Kaelin, W. G., Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing by metazoans: the central role of the HIF hydroxylase pathway. Mol Cell. 30, 393-402 (2008).
- Melvin, A., Mudie, S., Rocha, S. The chromatin remodeler ISWI regulates the cellular response to hypoxia: role of FIH. Mol Biol Cell. 22, 4171-4181 (2011).
- Bhinder, B., Djaballah, H. A simple method for analyzing actives in random RNAi screens: introducing the "H Score" for hit nomination & gene prioritization. Comb Chem High Throughput Screen. 15, 686-704 (2012).
- Bett, J. S., et al. The P-body component USP52/PAN2 is a novel regulator of HIF1A mRNA stability. Biochem J. 451, 185-194 (2013).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat Methods. 6, 569-575 (2009).
- Stagg, H. R., et al. The TRC8 E3 ligase ubiquitinates MHC class I molecules before dislocation from the ER. J Cell Biol. 186, 685-692 (2009).
- Zhang, Y., et al. RNF146 is a poly(ADP-ribose)-directed E3 ligase that regulates axin degradation and Wnt signalling. Nat Cell Biol. 13, 623-629 (2011).
- Jackson, A. L., et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Birmingham, A., et al. 3′ UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nat Methods. 3, 199-204 (2006).
- . Whither RNAi. Nat Cell Biol. 5, 489-490 (2003).
