siRNA的筛选识别泛素和泛素样系统压力表生物学途径在培养的哺乳动物细胞
Summary
在这里，我们描述了一种方法来执行对象的siRNA“ubiquitome”屏幕来识别对缺氧的HIF1A介导的细胞应答的新型泛素和泛素样调节剂。这可以适用于任何生物学途径，其中一个强大的读出报告基因活性的是可用的。
Abstract
与泛素和泛素样分子（UBLs）的蛋白质的翻译后修饰是一种新兴的一种调节多种生物学途径包括缺氧反应，proteostasis，DNA损伤反应和转录的动态细胞信号传导网络。为了更好地理解UBLs如何调控与人类疾病的途径，我们还编制了人类的siRNA“ubiquitome”库包括针对所有已知和预测的UBL系统路径组件1,186 siRNA双链池。该库可筛选针对一系列表达不同的生物途径的记者，以确定细胞系的UBL组件作为该途径中的问题的正或负调节。在这里，我们描述了利用这个库来识别ubiquitome，监管机构对缺氧的使用基于转录的荧光素酶报告的HIF1A介导的细胞应答的协议。初步试验发展阶段执行三个阶段进行屏幕之前建立的细胞系的合适的筛选参数：一级，二级和三级/反褶积审查。采用有针对性的在全基因组的siRNA库正变得越来越受欢迎，因为它仅提供了对通路成员与研究者最感兴趣申报的优势。尽管siRNA的筛选的固有的局限性，尤其是假阳性引起siRNA的脱靶效应，有问题的途径的真正新颖稳压器的识别胜过这些缺点，这可以通过执行一系列仔细进行的对照实验来克服。
Introduction
修改与泛素和泛素样分子（UBLs）蛋白质代表一个广阔的生化系统，调节多种生物学途径和应激反应。共价附着UBLs对它们的靶蛋白可以有不同的结果调节的稳定性，定位，功能，或在基板1的相互作用组。首先建立了泛素相关修饰UBL酶的步骤，现在作为修饰范式与大多数UBLs，包括相扑，NEDD8，ISG15和FAT10。对于发生变形例中，UBL二甘氨酸基序的羧酸酯基团通过一个E1活化酶首先被激活以形成被转移到一个E2结合酶的活性位点半胱氨酸的高能量硫醇。在E2然后用基板结合的E3连接酶相互作用介导的UBL转移到（通常情况下）的目标赖氨酸残基产生支链（异肽）联动2。连续多轮的修改可发生建立异肽链到衬底上，这对泛素可以发生通过其任何7赖氨酸，或通过其N-末端甲硫氨酸创建线性泛素链。这些修改形成离散拓扑结构具有不同的用途，如创造新的互动的图案和靶蛋白的降解之前，UBL去除专科蛋白酶。在泛素的情况下，有两种酶E1，E2 30-40结合酶，至少有600 E3连接酶和大约100去泛素化（配音）。而途径较少膨胀为其他10个左右UBLs，整体ubiquitome复杂能提供巨大的多样性在特定的UBL修饰的生物学结果。然而，虽然在UBL生物学的重大进展已经作出，大多数这些ubiquitome组件的精确细胞的作用尚不清楚。
使用短整型的erfering核糖核酸（siRNAs）的已成为在反向遗传学的有力工具，由于siRNA的特异性靶向细胞mRNA为破坏的能力，允许在不同的生物的上下文3被检个体的基因的作用。全基因组的屏幕已经被用于识别和验证的许多细胞过程的新的调节剂，并已创建接触到更广泛的科学界大量有用的数据。然而，在整个基因组中的屏幕已经被证明是非常有用的，有针对性的屏幕变得越来越受欢迎，因为它们更便宜，更快速，仅涉及对基因组的成员，其中，调查者是最感兴趣的更少的数据管理和报告。因此，为了更好地了解哪些细胞过程UBL的家庭成分都参与了，我们还编制了人类的siRNA库中针对所有已知和预测的ubiquitome的组成部分。这包括UBLs，E1活化酶，E2缀合酶，E3连接酶，含蛋白质和配音泛素结合结构域（UBD）。这个库可以用于对多种的不同的生物学问题报告细胞系的屏幕，从而使公正鉴定新的UBL组件监管这些途径。
以下协议说明如何执行严格的有针对性的siRNA ubiquitome屏幕识别HIF1A依赖性反应缺氧新型稳压器。在正常的氧张力，HIF1A受脯氨酰羟化，导致它的希佩尔林道（VHL）E3连接酶复合体4被认可和有针对性的退化。缺氧抑制脯氨酰羟化导致HIF1A的稳定和其随后的结合缺氧反应元件（的HRE）驱动的基因表达。在这里，我们描述了一个屏幕采用U20S骨肉瘤细胞的海兰三个串联拷贝的控制下稳定表达萤火虫荧光素酶poxia反应元件（U20S-HRE细胞）5。这个协议可以适于任何生物学途径是否健全读出的报告基因活性的是可以实现的，并且可以加上适当的阳性和阴性对照。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用在哺乳动物细胞中的全基因组siRNA筛选已被证明是在确定不同的生物途径新颖监管极其宝贵的。这里，我们已经描述了使用靶向ubiquitome siRNA筛选，以识别对缺氧的HIF1A介导的细胞响应的调节剂。有针对性的屏幕也变得越来越有吸引力，因为他们一般都比较便宜，更快，更容易管理，只有对通路组件中，研究者有兴趣7，10，11的报告。
它把一个重大努力进入检验发?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由威康信托基金会，葛兰素史克（GSK）和苏格兰研究所细胞信号（即现在的MRC蛋白质磷酸化和泛素化单元的一部分）的支持。
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
Riferimenti
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