siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate
Summary
Qui, descriviamo una metodologia per eseguire un siRNA mirato "ubiquitome" schermo per identificare nuovi ubiquitina e regolatori ubiquitina-simile della risposta cellulare HIF1a-mediata all'ipossia. Questo può essere adattata a qualsiasi percorso biologico in cui una lettura robusto di attività di giornalista è disponibile.
Abstract
Modificazione post-traslazionale di proteine con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) sta emergendo come una rete di segnalazione cellulare dinamica che regola diverse vie biologiche, tra cui la risposta all'ipossia, proteostasis, la risposta al danno al DNA e la trascrizione. Per capire meglio come UBLs regolano i percorsi relativi alla malattia umana, abbiamo compilato una siRNA umano "ubiquitome" biblioteca composta da 1.186 siRNA piscine su due piani destinati a tutti noti e previsti componenti dei percorsi del sistema UBL. Questa libreria può essere proiettato contro una serie di linee cellulari esprimenti reporter di diverse vie biologiche per determinare i componenti UBL agiscono come regolatori positivi o negativi della via in questione. Qui, descriviamo un protocollo che utilizza questa libreria per identificare ubiquitome-regolatori della risposta cellulare HIF1a-mediata all'ipossia utilizzando un reporter luciferasi basato trascrizione. Una fase di sviluppo iniziale di analisiviene eseguita per stabilire parametri di schermatura della linea cellulare prima di eseguire lo schermo in tre fasi: di screening / deconvoluzione primaria, secondaria e terziaria. L'uso di mirata su intere librerie genoma siRNA sta diventando sempre più popolare in quanto offre il vantaggio di notifica solo per i membri del percorso con cui i ricercatori sono più interessati. Nonostante i limiti intrinseci dello screening siRNA, in particolare falsi positivi causati da siRNA effetti off-target, l'identificazione di veri e propri nuovi regolatori dei percorsi in questione superano queste carenze, che possono essere superati eseguendo una serie di esperimenti di controllo con attenzione intraprese.
Introduction
Modifica delle proteine con ubiquitina e ubiquitina-come molecole (UBLs) rappresenta un sistema biochimico espansiva che regola diverse vie biologiche e risposte allo stress. L'attacco covalente di UBLs alle loro proteine bersaglio può avere vari risultati che regolano la stabilità, localizzazione, funzione o interattoma del substrato 1. I passaggi enzimatici sottostanti modifica UBL sono stati stabiliti in primo luogo per ubiquitina, e ora servono come paradigma per la modifica con la maggior parte UBLs, tra cui SUMO, NEDD8, ISG15 e FAT10. Per modifica si verifichi, il gruppo carbossilato del diglycine motivo LBM viene prima attivato da un enzima attivando E1 a formare un tiolo ad alta energia che viene trasferita al sito attivo di un enzima cisteina coniugare E2. Il E2 poi interagisce con un substrato con associazione E3 ligasi di mediare trasferimento della LBM su (di solito) un residuo di lisina bersaglio creando una catena ramificata (isopeptide) linkage 2. Cicli successivi di modifica può verificarsi per costruire catene isopeptide sul substrato, che per ubiquitina può avvenire attraverso uno dei suoi sette lisine, o attraverso la metionina N-terminale per creare catene di ubiquitina lineari. Queste modifiche formano topologie discrete con finalità diverse come la creazione di nuovi motivi di interazione e di targeting delle proteine per la degradazione prima della rimozione UBL da proteasi specializzati. Nel caso di ubiquitina ci sono due enzimi E1, E2 30-40 enzimi coniugando, almeno 600 E3 ligasi e circa 100 enzimi deubiquitylating (Dubs). Mentre le vie sono meno espansiva per gli altri 10 o giù di lì UBLs, complessità generale ubiquitome offre grande diversità nel risultato biologico di una modifica particolare UBL. Tuttavia, mentre sono stati compiuti importanti progressi nella UBL biologia, i ruoli cellulari precise della maggior parte di questi componenti ubiquitome rimangono sconosciute.
L'uso di short intacido ribonucleico erfering (siRNA) è emersa come un potente strumento in genetica inversa a causa della capacità di siRNA per indirizzare specificamente mRNA cellulari per la distruzione, consentendo il ruolo dei singoli geni da esaminare in contesti biologici differenti 3. Schermi genoma interi sono stati utilizzati per identificare e validare nuovi regolatori di molti processi cellulari, e hanno creato una grande quantità di dati utili accessibili alla più ampia comunità scientifica. Tuttavia, mentre gli schermi intero genoma si sono dimostrati estremamente utili, schermi mirati stanno diventando sempre più popolari come sono più economici, più veloci, coinvolgere meno la gestione dei dati e la relazione solo sui membri del genoma in cui il ricercatore è più interessati. Pertanto, per capire meglio quali componenti della famiglia processi cellulari UBL sono coinvolti in, abbiamo compilato una libreria siRNA umano mira tutti noti e previsti componenti del ubiquitome. Questo include i UBLs, E1, E2 enzimi attivatori coniugandoenzimi, ligasi E3, ubiquitina-legame dominio (UBD) contenenti proteine e dubs. Questa libreria può essere usata per schermo contro un'ampia gamma di linee cellulari giornalista di problemi biologici distinti, permettendo così l'identificazione corretto di componenti UBL nuovi disciplinano queste vie.
Il protocollo che segue descrive come eseguire un rigoroso siRNA mirato ubiquitome schermo per identificare nuovi regolatori della risposta HIF1a-dipendente all'ipossia. Sotto tensione normale di ossigeno, HIF1a è soggetto a idrossilazione prolyl che induce a essere riconosciuto e mirato per la degradazione da parte del Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligasi complesso 4. Ipossia inibisce idrossilazione prolyl porta alla stabilizzazione di HIF1a e il suo successivo legame ad elementi di risposta ipossia (HRES) per guidare l'espressione genica. Qui, descriviamo uno schermo mediante cellule di osteosarcoma U20S che esprimono stabilmente lucciola luciferasi sotto il controllo di tre copie tandem del Hypoxia Response Element (cellule U20S-HRE) 5. Questo protocollo può essere adattato per qualsiasi via biologica se un robusto lettura di attività di giornalista è realizzabile e può essere accoppiato con appropriati controlli positivi e negativi.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'uso di genoma di ampiezza schermi siRNA in cellule di mammifero ha dimostrato di essere estremamente utile per identificare nuovi regolatori di vie biologiche distinte. Qui, abbiamo descritto l'uso di uno schermo ubiquitome siRNA targeting per identificare regolatori della risposta cellulare HIF1a mediata da ipossia. Schermi mirati stanno diventando sempre più attraente in quanto sono generalmente più economiche, più veloce, più facile da gestire e riferire solo sui componenti della via in cui gli investig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da The Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) e l'Istituto scozzese per la segnalazione cellulare (ora parte della proteina fosforilazione MRC e l'unità ubiquitylation).
Materials
| Automated Liquid Dispenser | Fluid-X | XPP-721 | http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html |
| Automated cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html |
| Hypoxia Workstation | Ruskin | In vivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 |
| Automated Cell Dispenser | Thermo Scientific | Matrix Wellmate | http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11 |
| Plate Shaker | Heidolph | Titramax 1000 | http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/ |
| Luminometer | Perkin Elmer | Envision 2104 Multilabel Reader | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers |
| White Walled Assay Plate | Greiner Bio One | 655083 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/ |
| Clear Plate Film | Perkin Elmer | 1450-461 | http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461 |
| Name of the Reagent | |||
| siRNA library | Thermo Scientific | On-Target Plus | http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/ |
| Transfection reagent | Invitrogen | Lipofectamine RNAimax | http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html |
| Reduced Serum Medium | Invitrogen | Optimem | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039# |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product# |
| Tryspin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product# |
Riferimenti
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