Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Summary

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Abstract

Heme serve como o grupo prostético de uma grande variedade de proteínas conhecidas como hemoproteinas, tais como a hemoglobina, mioglobina e citocromos. Ele está envolvido em vários processos moleculares e celulares, tais como a transcrição do gene, tradução, diferenciação celular e a proliferação celular. Os níveis de biossíntese do heme variar entre diferentes tecidos e tipos de células e é alterada em condições de doença, tais como a anemia, neuropatia e cancro. Esta técnica utiliza [4- ¹⁴ C] ácido 5-aminolevulínico ^([14 C] 5-ALA), um dos primeiros precursores na via de biossíntese do heme para medir os níveis de síntese do heme em células de mamíferos. Este ensaio envolve a incubação de células com ^[14 C] 5-ALA, seguido por extracção do heme e medição da radioactividade incorporada no heme. Este procedimento é preciso e rápido. Este método mede os níveis relativos de heme, em vez de o teor total do heme. Para demonstrar o uso da presente technique os níveis de biossíntese do heme foram medidos em várias linhas de células de mamíferos.

Introduction

O heme, um complexo de ferro ferroso e protoporfirina IX é uma molécula central para o transporte e a utilização de oxigénio em organismos vivos praticamente todos ^1-3. A estrutura única do heme lhe permite funcionar como um transportador de gases diatómicos e electrões, assim como para executar diversas outras funções ^1-5. Por exemplo, liga-se ao heme oxigénio na hemoglobina e mioglobina de transferência e armazenagem de ^6,7 oxigénio. Ele também funciona como um transportador de electrões nos citocromos durante a respiração e atua como um doador de elétrons para reações redox catalisada por enzimas do citocromo P450 ^8,9. Uma das características mais significativas do heme é que, pode desempenhar papéis regulatórios em processos celulares e moleculares, como a transcrição de genes, síntese de proteínas e micro-RNA biogênese ^4. Por exemplo, afecta a transcrição de muitos genes, controlando a actividade do repressor de transcrição de mamífero Bach1 e o rec nucleares de mamíferoseptor Rev-erbα ^10-15. Heme regula a activação do activador de proteína heme (Hap) 1, o qual desempenha um papel importante na activação de genes envolvidos na respiração e controlar os danos oxidativos, em resposta a heme ou oxigénio ^16. Heme também regula a transcrição de genes em células neuronais através do factor de crescimento do nervo (NGF) de sinalização ^3,17-20. É também regula a síntese de proteínas em células eritróides de mamíferos através da modulação da actividade da heme-reguladas eIF2α quinase (HRI) ^21-24. Além disso, o heme afecta a actividade das proteínas principais de sinalização, tais como tirosina-quinase Src e Jak2, que são essenciais para o funcionamento adequado das células e o crescimento de células ^4,20,25. Verificou-se que, em células HeLa inibição heme provoca paragem do ciclo celular e a activação de marcadores associados à senescência e a apoptose ^26. Tanto a deficiência heme ou aumento dos níveis de heme estão associados com efeitos graves para a saúde em seres humanos ^27. Um molecular recentend estudos epidemiológicos têm mostrado uma associação positiva do consumo elevado de heme e aumento do risco de doenças, tais como diabetes tipo 2, doenças coronárias e vários tipos de câncer, incluindo câncer de pulmão, cancro colo-rectal e cancro do pâncreas ^27,28. Usando um par combinado de laboratório células pulmonares normais e cancerosas autores descobriram que as células cancerosas se aumentaram os níveis de consumo de oxigênio, a síntese do heme e proteínas envolvidas na absorção de oxigênio heme e utilização ^28. Curiosamente, a inibição da síntese do heme diminuição do consumo de oxigénio, proliferação, migração e formação de colónias de células de cancro ^28. Deste modo, a flutuação nos níveis de heme endógena desempenha um papel importante na regulação de processos celulares e moleculares ^3,4,28,29.

Nos mamíferos, a biossíntese do heme ocorre em oito passos, envolvendo enzimas localizadas nas mitocôndrias e o citosol ⁴ (Figura 1). Heme biostese começa na matriz de mitocôndria com a condensação de glicina e succinil-CoA para formar ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), catalisada por sintase de ALA (Alas) ^4,31. Este é o passo limitante da velocidade na biossíntese do heme em células nonerythroid. 5-ALA é então exportado para o citosol onde as quatro etapas seguintes ocorrem para formar coproporfirinogênio III (CPgenIII), o qual é então novamente importados para as mitocôndrias, onde é convertido em protoporfirina IX (PPIX). Finalmente, uma molécula de ferro é incorporado à protoporfirina IX (PPIX) para produzir o heme, numa reacção catalisada por ferroquelatase (FEQ) ^2,4.

O nível da biossíntese do heme depende principalmente do nível de enzima ALA que é rigorosamente controlada por ferro intracelular e heme ^4. A biossíntese do heme podem ser afectadas por defeitos genéticos, disponibilidade de certos minerais e vitaminas (por exemplo, riboflavina, zinco), exposição a toxinas (por exemplo, alumínio, chumbo), Anoxia, febre, e os níveis de certos esteróides (por exemplo, estrogénio) ^32-35. O nível de síntese do heme é alterada em várias condições de doença. Diminuição da biossíntese do heme pode causar anemia, bem como doenças neurológicas ^3,36. Alternativamente, o aumento da biossíntese do heme desempenha um papel importante na progressão de certos cancros ^28,37. O heme tem sido demonstrado que é crítica para o crescimento, diferenciação e sobrevivência de tecido adiposo de mamífero, eritróide e de células neuronais ^4,38-41. Por exemplo, a deficiência de heme leva a danos de neurites em neurónios corticais de rato primária através da inibição de glutamato de NMDA (N-metil-D-aspartato) do receptor ^17. Além disso, a inibição da síntese do heme provoca a morte celular programada no humano Carcinoma epitelial do colo células HeLa ^26,41. Portanto, a medição dos níveis de biossíntese do heme em várias células sob diferentes condições é importante para o estudo de etiologia e progressino de muitas doenças.

Aqui, descrevemos um método rápido e sensível para medir o nível de síntese do heme intracelular utilizando [4- ¹⁴ C] ácido 5-aminolevulic. Este é um método alternativo para os métodos que utilizam outros ⁵⁵ Fe ou ^59Fe. Nós preferimos usar ¹⁴ C, porque a sua radiação é muito fraco. Em contraste, a protecção forte é necessário para trabalhar com isótopos Fe. Além disso, este método se destina a medir e comparar a síntese do heme em células diferentes em paralelo de uma maneira rápida. A fim de medir os níveis absolutos de heme, pode-se utilizar o método previamente estabelecido, envolvendo o uso de HPLC de ^42,43.

Protocol

CUIDADO: Ao trabalhar com radioatividade, tomar as precauções adequadas para evitar a contaminação do experimentador e os arredores. Elimine todos os resíduos fora de seguir as diretrizes de segurança de radiação local. 1. Preparação de células Semear as células em placas de 3,5 centímetros de tal modo que a confluência atinge 80% -90% em relação ao dia do ensaio. Note-se que sementeira confluência de células depende do tipo de célula e a sua taxa de cr…

Representative Results

Este método foi utilizado para comparar os níveis de síntese do heme em condições normais (HBEC30KT) vs cancerosas (células de pulmão HCC4017). A Figura 2 mostra um nível mais elevado da síntese de heme em células de cancro (HCC4017) do que as células normais de pulmão (HBEC30KT). O nível de síntese do heme foi medido também em células normais e cancerosas, na presença de cianeto de carbonilo mitocondrial desacoplador 3-clorofenilhidrazona (CCCP). As células foram tratadas com 10 mM de…

Discussion

O heme desempenha um papel fundamental na geração de energia celular através da respiração ^26. Metabolismo do heme Altered é conhecida por estar associada com várias doenças, incluindo cancro ^28,41. A inibição da síntese do heme é conhecido por causar a paragem do ciclo celular e apoptose em células Hela ^26,41. Demonstrou-se que o nível de síntese de heme está associada com a progressão de células de cancro de pulmão ^28. Portanto, seria de grande importânci…

Materials

Acetone	Sigma	650501
Diethy ether	Sigma	296082
HCl (Hydrochloric acid)	Fisher	A481-212
Liquid Scintillation cocktail	MP Biomedicals	882470
Trypan blue	Gibco	15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid	Perkin-Elmer life sciences		Store @  -80 °C
CelLytic M	Sigma	C2978	Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227
Specific reagent
	Component	Dispense
Heme extraction buffer- Acetone: HCl:Water (25:1.3:5)	Acetone	25ml
	Concentrated HCl	1.3ml
	Water	5ml