Summary
Syntese og fremstilling af Electrospun lange fibre spænder over en større indbetaling området via en nydesignet indsamler fra en roman biologisk nedbrydelig polymer kaldet poly (glycerol-dodecanoat) (PGD) blev rapporteret. Fibrene var i stand til at understøtte væksten af celler fra mus pluripotente stamceller.
Abstract
For vævsdyrkningsapplikationer, forberedelse af biologisk nedbrydelige og biokompatible stilladser er den mest ønskelige, men udfordrende opgave. Blandt de forskellige fremstillingsmetoder, electrospinning er den mest attraktivt på grund af sin enkelhed og alsidighed. Derudover Electrospun nanofibre efterligne størrelsen af naturlig ekstracellulær matrix, hvilket sikrer yderligere støtte til celleoverlevelse og vækst. Denne undersøgelse viste, at levedygtigheden af fremstillingen af lange fibre, der spænder over et større indbetaling område for en hidtil ukendt biologisk nedbrydelig og biokompatibel polymer navnet poly (glycerol-dodecanoat) (PGD) 1 under anvendelse af en nyudviklet kollektor til electrospinning. PGD udviser unikke elastiske egenskaber med lignende mekaniske egenskaber til nervevæv, derfor er det velegnet til neurale vævsdyrkningsapplikationer. Syntesen og fabrikation set-up for at gøre fibrøse stilladser materialer var enkel, meget reproducerbar, og billig. I biokompatibilitetafprøvning, kunne celler fra mus embryonale stamceller overholde og vokse på Electrospun PGD fibre. Sammenfattende denne protokol, forudsat en alsidig fabrikation metode til at gøre PGD Electrospun fibre til at understøtte væksten af musen embryonale stamceller afledte neurale afstamningsceller.
Introduction
Electrospinning er en af de effektive behandling metoder til at producere mikro-til-nanometer størrelse fiber stillads. Det grundlæggende princip i electrospinning indebærer en Taylor kegle af løsning, der afholdes på åbningen af en nål ved at anvende høj spænding mellem spidsen af nålen og en jordet samler. Når den elektrostatiske frastødning i løsningen overvinder overfladespændingen er et opladet fluidstråle skubbet ud af nålespidsen, rejser gennem luften med opløsningsmiddel fordampning, og endelig deponeres på jordet solfanger. Sprøjtepumpen tilvejebringer en kontinuerlig strøm af opløsningen kommer ud fra spindedysen, og dermed flere kopier af Electrospun fibre kan fremstilles inden for en kort periode. Under forlader spindedysen at ankomme til opkøber, vil opkrævet jet gennemgå stretching og piskning i henhold til en række parametre, der omfatter viskositeten og overfladespændingen af polymere løsning, de elektrostatiskec kraft i opløsningen, og interaktionen af eksterne elektriske felt, osv. 2..
I elektrospinningsprocessen, en opkøber fungerer som et ledende substrat, hvor mikro-til-nanometer fibre kan deponeres. I denne undersøgelse blev en ny type fibre samler designet til at opnå fibermåtter med den ønskede størrelse (længde x bredde). Traditionelt er aluminiumfolie anvendes som en samler, men det er vanskeligt at overføre fibrene fra den flade overflade til et andet substrat. Vanskeligheden ved at høste en intakt fiber måtten fra en traditionel solfanger skyldes primært det faktum, at Electrospun fibre vedhæfte kraftigt til opkøber overflade. , Modificerede vi derfor samleren ved at folde et stykke aluminiumsfolie i en rektangulær strimmel og fastgørelse af den vinkelret på en flad metalplade. De Electrospun fibre strækkes over området mellem spidsen af strimlen og metalpladen, som let kan overføres til en anden Substrate.
Interessen for termisk tværbundet elastomere polymerer er hastigt voksende på grund af den banebrydende arbejde af Robert Langer gruppe, som introducerede poly (glycerol sebacate) (PGS), en polyester, som er analog med vulkaniseret gummi i 2002 3. Svarende til PGS har vi med succes udviklet poly (glycerol-dodecanoat) (PGD) ved termisk kondensation af glycerol og dodecandisyre og demonstreret sin unikke form hukommelse ejendom 1. I modsætning stivere syntetiske materialer poly (hydroxyl-butyrat) eller poly (L-lactid) (Young moduli på 250 MPa og 660 MPa, henholdsvis), PGD udviser elastomere egenskab som gummi, med en Youngs modul på 1,08 MPa, når temperaturen er over 37 ° C, som er en tæt match til in situ perifer nerve (0,45 MPa). Desuden PGD er biologisk nedbrydelige og nedbrydningstiden kan finjusteres ved at variere forholdet af glycerol og dodecandisyre. Dodecandisyre er en tolv-carbon subholdning med to terminale carboxylgrupper, HOOC (CH2) 10 COOH. Selv nummererede dicarboxylsyrer som sebacinsyre og dodecandisyre kan metaboliseres til acetyl-CoA og indtast tricarboxylsyre (TCA) / (citronsyre) cyklus. Den metaboliske produkt af dicarboxylsyrer, succinyl-CoA, er en gluconeogenetic forløber og mellemliggende TCA cyklus 4. Således nogle undersøgelser tydet på, at de kunne anvendes som alternativt brændstof substrat til enteral og parenteral ernæring, især i de patologiske tilstande. Desuden PGD udviser unikke formhukommelse fordi dens glasovergangstemperatur er 31 ° C, således at det viser forskellige mekaniske egenskaber ved stuetemperatur og ved legemstemperatur. I sum, PGD er biologisk nedbrydeligt, biokompatible, udstiller unikke elastiske egenskaber med mekaniske egenskaber svarende til nervevæv; derfor er et egnet materiale til nervevæv ingeniørmæssige anvendelser. I denne protokol, det electrospunlange fibre spænder et stort depositum område blev fremstillet via det nydesignede indsamler fra PGD. Fiberen stilladser kan understøtte mus pluripotente stamceller vækst og differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Electrospinning Collector Setup
- Skær aluminiumsfolie i et rektangulært stykke.
- Fold rektangulært stykke ind i en rektangulær strimmel, og vedhæft det vinkelret på en flad metalplade med tape (Figur 1). Bemærk: Størrelsen på fibermåtten afhænger af længden og bredden af strimlen. Således kan striben dimensioner justeres efter behov.
2.. Polymeropløsning Fremstilling
- Bland glycerol og dodecandisyre (DDA) i 1:1 molforhold i et bægerglas ved 120 ° C i 100 timer til opnåelse af PGD polymer.
- Opløses poly (ethylenoxid) (PEO) og gelatine i 65% ethanol med et vægtforhold på 1.5:3:95.5 i et 15 ml rør, stramme hætten og blandingen opvarmes i en ovn ved 60 ° C i 1 time under omrøring indtil den bliver en homogen opløsning (Basal opløsning).
- For electrospinning blandes PGD polymer og den basale opløsning i 04:06 vægtforhold. Bemærk: PGD koncentration har en big effekt på fiber diameter. 30% -50% procent PGD er acceptabelt at producere fibre, er længere end 5 cm med øget fiberdiametre.
- Tilføj 0,1% riboflavin til den polymere opløsning, og bland godt.
3. Electrospinning
- Feed den polymere opløsning i en 5 ml standard sprøjte med en 18 G afstumpet kanyle af rustfrit stål.
- Sæt sprøjten ind i en sprøjtepumpe.
- Fastgør jordet spidsen af en højspændingsledning kilde til metalpladen og positivt ladede føre til nålen.
- Justér afstanden mellem nålen og aluminiumfolien strimlen til 15 cm.
- Placer sprøjtepumpe i en vinkel på omkring 15 ° med vandret for at forhindre aggregering af fibrene på forsiden af strimlen.
- Tænd sprøjtepumpen og justere strømningshastigheden for pumpen til 0,6 ml / time.
- Tænd for højspændingsledning kilde og indstil driftsspænding til 14,6 kV.
4..Fiber Processing
- Efter samling er komplet udsætter fibermåtte for UV-lys i 60 minutter for tværbinding.
- Overfør fibermåtte fra aluminiumsfolie strimlen til en 100 mm petriskål, og udsætte det for UV-lys i yderligere 20 minutter til sterilisering.
- I en biosikkerhed kabinet, skære fibermåtte i runde stykker af samme størrelse med en kirurgisk kniv og placere stykkerne i en 24-brønds plade.
- For celle før såning behandling fordybe fiberprøver i 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Den følgende dag aspireres PBS omhyggeligt, tilsættes 1 ml af differentiering medium (DMEM/F12, N2 og FGF2) (se opskrift i Materialer tabel) til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 3 timer.
- Aspirer differentiering medium forsigtigt tilsættes 0,2 ml Matrigel til hver fiberprøve og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter. Bemærk: Laminin kan også anvendes til fibercoating. Tilsæt 0,2 ml 20 pg / ml laminintil fiberen og inkuber ved stuetemperatur i 3 timer.
- Fjern omhyggeligt overskydende matrigel fra hver brønd. Skyl med 2 ml af differentiering medium gang. Bemærk: fiberprøver De er klar til celledyrkning.
5.. Cellepodning på fibre
- Tilsæt 1 ml Accutase til MES celledyrkningsskål og inkuberes i 10 minutter ved 37 ° C.
- Efter 10 min, er MES cellerne løsrevet fra kultur fad. Tilsæt 4 ml differentiering medium til pladen. Saml de flydende MES celler i et 15 ml rør og pipettespidser celler op og ned for at bryde kolonier (ca. 15x).
- Centrifugeres ved 400 xg i 5 minutter og genopslæmmes cellerne i 4 ml differentiering medium.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer. Overfør 200 pi af cellesuspensionen i et 15 ml rør og fortynd det 10x med differentiering medium. Overfør 15 ul af den fortyndede cellesuspension til et kammer på hæmocytometeret med en cover-slip på plads. Tælcellerne i 1 mm midterste firkant og de fire hjørne kvadrater af hæmocytometeret under mikroskop. Bemærk: Cell per ml = gennemsnittet tæller pr kvadrat x fortyndingsfaktoren x 10 4
- Placer cirka 5 x 10 4 MES celler på hver brønd. Langsomt falde cellesuspensionen på midten af fiberprøver, i stedet for at glide ud til siden af brønden, for at forhindre opløsningen fra aftapning fibermåtten.
- Der tilsættes 1 ml differentiering medium til hver brønd, og holde pladen i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 for at tillade celler vedhæftning, vækst og differentiering.
- Aspirer gamle medium fra hver brønd og erstattes med 1 ml frisk differentiering medium hver anden dag.
6.. Cellelevedygtighed
- Aspirer gamle medium fra hver brønd.
- Bland 1/10 th volumen Resazurin fluorescens reagens med dyrkningsmedium og tilsættes 1 ml til hver brønd.
- Incubspiste ved 37 ° C og 5% CO2 i 4 timer og beskyttet mod direkte lys.
- Efter 4 timer, overføres der 100 ul 3x af reagenset fra hver brønd til en 96-brønds plade, og så prøverne er klar til at blive målt på en fluorescensspektrofotometer hjælp 560EX nm/590EM filterindstillinger.
7.. Real Time PCR
- Efter 14 dages dyrkning, tilsættes lysepuffer prøverne og isolere total RNA fra cellerne på fiberprøverne.
- Brug 4 pi total RNA til at syntetisere cDNA i 20 pi reaktionsprodukter skalaer ved revers transkription.
- Forbered PCR-reaktionsblandingen i hver optisk rør: 10 gl Master Mix (2x), 0,2 pi farvestof, 8 pi Nuclease-Free vand, 1 ul cDNA, og 1 pi primer (Primere anvendt i denne undersøgelse er anført i tabel 1).
- Opsætning af PCR-program: en. 95 ° C 02:20 min, 1 cyklus b.. 95 ° C 3 sek → 60 ° C 1 min, 40 cyklus ca. 95 ° C 15 sek, 1 cyklus d. 60 ° C 1min, 1 cycle e. 95 ° C 15 sek, 1 cyklus. Vælg sammenlignende metode C T til at bestemme relative genekspression niveauer.
- Efter PCR er færdig, analysere real-time PCR-resultater med StepOne software og eksportere resultaterne til Excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De væsentligste komponenter i elektrospinningsprocessen er vist i fig. 1. En stor størrelse fibermåtte blev typisk opnået ved vinkelret fastgjort aluminiumfolie strimler og en flad metalplade. Figur 2 viser samleren design og elektrospinningsprocessen fibermåtte. Bredden og længden kan justeres til forskellige applikationer. Længden af fiberen fremstillet med PGD polymer og basal opløsningsblanding er op til 10 cm. Morfologi Electrospun fibre er vist i fig. 3. diametre fibre fremstillet fra 40% PGD koncentration er i mikrometer rækkevidde. Konfokal mikroskopi billeder af differentierede celler afledt fra MES celler dyrket i 3 og 6 dage på fibre er afbildet i fig. 4. Den grønne fluorescerende signaler kom fra over-ekspressionen af grønt fluorescerende protein (GFP) i cellerne. Resultatet af Resazurin fluorescens reagens i figur 5 viste, at MES celler voksern på PGD fibre belægning med matrigel og laminin havde tilsvarende celle levedygtighed og havde relativt højere spredning i forhold til den ikke-coatede gruppe. Genekspressionen af pluripotency og neurale celler markører blev kvantificeret ved real time PCR (figur 6). Størstedelen af MES celler dyrket på fibre udtrykte pluripotency markører OCT4, Nanog og Sox2 mens mindretallet af celler udtrykte neural stamcelle markerer PAX6 og Nestin. Efter 2 ugers dyrkning, MES dyrket på fibre viste øgede ekspressionsniveauer af neurale celle varemærker, såsom MAP2 og DCX samt oligodendrocyt markør Oligo1 og astrocyt markør GFAP.
Figur 1.. Electrospinning oprettet. Den polymere løsning udstødes fra en stump nål. En høj spænding strømkilde grunde en flad metalplade ennd en aluminiumfolie strimler, mellem hvilke mikro-til-nano meter fibre aflejres (blå).
Figur 2. Collector design og electrospun fibermåtte. Bredden og længden af fibermåtten kan let ændres ved at justere størrelsen af aluminiumsfolie strimmel. Der er ingen grænse for måtten bredde og de længste fibre kan være op til 10 cm lang.
Figur 3. SEM billeder af electrospun PGD og basal opløsning 4:06 (vægt / vægt). Den gennemsnitlige diameter af fibrene er omkring 2 um. Når PGD koncentrationen falder til 30%, den gennemsnitlige diameter af fibrene falder i nanometer området. Den hvideMålestokken repræsenterer 10 um.
Figur 4.. Konfokal mikroskopi billeder af differentierede MES celler på fibre. De celler, der bærer GFP udstille lyse grøn fluorescens, når de udsættes for lys i blå til ultraviolette område. Det øgede antal af grønne fluorescerende celler på dag 6 viser, at fiber stilladser kan understøtte celleadhæsion og spredning. Den hvide Målestokken repræsenterer 100 um. (Dag 3 og dag 6).
Figur 5. Cellelevedygtigheden af MES celler på PGD fibre belægning med Matrigel og laminin ved 1, 3 og 5 dage som bestemt ved Resazurin fluorescence reagens. Celler dyrket på ikke-coatede fibre, der anvendes som kontrol (p <0,05).
Figur 6.. QRT-PCR-analyse af genekspression i differentierede MES celler på PGD fibre. De neurale cellemarkører tydelige efter 2 uger viste, at MES cellerne på stilladserne er differentieret i neurale celler.
| mGAPDH-L | AACTTTGGCATTGTGGAAGG |
| mGAPDH-R | ACACATTGGGGGTAGGAACA |
| mOct4-L | CACGAGTGGAAAGCAACTCA |
| mOct4-R | AGATGGTGGTCTGGCTGAAC |
| mNanog-L | AAGTACCTCAGCCTCCAGCA |
| mNanog-R | GTGCTGAGCCCTTCTGAATC |
| mSox2-L | CACAGTTCAGCCCTGAGTGA |
| mSox2-R | AGGCCACAACAACAACAACA |
| mPax6-L | AACAACCTGCCTATGCAACC |
| mPax6-R | ACTTGGACGGGAACTGACAC |
| mNestin-L | CCAGAGCTGGACTGGAACTC |
| mNestin-R | ACCTGCCTCTTTTGGTTCCT |
| mMAP2-L | CTTATGGGAATGTGGGATGG |
| mMAP2-R | AAAAAGTGGGCCTTGGAACT |
| mDCX-L | ATGCAGTTGTCCCTCCATTC |
| mDCX-R | ATGCCACCAAGTTGTCATCA |
| mOligo1-L | CTTGCTCTCTCCAGCCAAAC |
| mOligo1-R | GCGAGCCTGAAAAACAGAAC |
| mGFAP-L | CACGAACGAGTCCCTAGAGC |
| mGFAP-R | ATGGTGATGCGGTTTTCTTC |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Begrænsningerne af simple samlere eller kompleksiteten i roterende samlere, der i øjeblikket anvendes til electrospinning øge begrænsning for at opnå den ønskede længde og størrelsen af fiber mat for nogle programmer. Derudover overfører fibre fra jorden solfanger til kulturen parabol eller andre substrater er en udfordring 5.. , En nydesignet opkøber, gøres blot ved at fastgøre en aluminiumsfolie strimmel til jordet opkøber, var i stand til at opnå store størrelse fibermåtter op til 10 cm med 20 cm ad gangen i denne rapport. Figur 1 og 2 illustrerer den skematiske opsætning designet til fabrikere op til 10 cm lange Electrospun fibre med kontrolleret mat bredde. Påvirket af elektrostatiske felt mellem nålespidsen og samler blev Electrospun fibre strækkes over området mellem aluminiumsfolie strimler og jordet kollektor til en glat fiber mat, som let kan overføres til en anden substrate. Electrospun fibre giver porøse fibrøse strukturer, der tillader cellerne at bygge bro og knytte til flere fibre i en virkelig tredimensionelt miljø. De fibermåtter genereres i denne undersøgelse er store nok til at gøre dem ideelle kandidater til en bred vifte af anvendelser, såsom sårheling og neural regenerering.
Fiberdiametre kan justeres ved at styre flere variable i elektrospinningsprocessen procedure. Disse variabler omfatter polymerkoncentrationen, størrelsen af påtrykt spænding, polymer levering sats, afstand fra nålen til opkøber osv 6-8. I denne undersøgelse blev de test løsninger, som blev sammensat med 50% PGD og 50% BS, 40% PGD og 60% BS, 30% PGD og 70% BS, og 20% PGD og 80% BS henholdsvis forberedt gør Electrospun fibre. De fibrøse stilladser blev undersøgt ved hjælp af SEM for at bestemme diametre og morfologier for fibrene (fig. 3). Som forventet højere koncentrationer PGD produced større diametre Electrospun fibre. Det er også afgørende at justere afisoleringslængde henhold til de forskellige PGD koncentrationer. En lavere PGD koncentration kræver en kortere strimmel længde for at sikre fibre formation.
Der er gjort mange anstrengelser for at udforske biokompatibilitet af de Electrospun fibrøse stilladser gennem studiet af cellekultur 9-13. Konfokal mikroskopi billeder i figur 4 viser, at de vedhæftede celler med stærke grønne fluorescerende signaler indikerede celleoverlevelse på PGD fibre. Desuden celledensiteten stigende fra dag 3 til dag 6 foreslog også celleproliferationen på PGD fibre. Cellelevedygtigheden test i figur 5 bekræfter også, at dette resultat. Genekspressionen af neurale celleslut MAP2 og DCX påvist, at MES-celler var i stand til at differentiere i neurale celler på stilladserne (figur 6). Afslutningsvis kunne PGD fiber stilladser understøtte celle adhesion og spredning, og dermed udviser potentiale for neurale vævsdyrkningsapplikationer.
Her er nogle retningslinjer generelle fejlfinding: Hvis fiberen kommer ud af nålen er diskontinuerlig, varme op polymeropløsningen igen og bland godt, eller hvis fiberen klæber til aluminiumfolien strimler uden tiltrækning til metalpladen, reducere strimlen længde eller øge PGD koncentration. Sommetider store polymer globs dannes ved nålespidsen, skal du slukke den høje spænding strømkilde, tørres af med en køkkenrulle, og reducere levering sats af pumpen. Desuden undertiden fibre samlet på den øvre kant af aluminiumsfolie strimler prøve at justere vinklen af sprøjtepumpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev udført ved hjælp af faciliteterne i Biomedical Engineering Department ved Florida International University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 | |
| Dodecanedioic acid | Sigma-Aldrich | D1009 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | D1890 | |
| Poly(ethylene oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 182028 | |
| Riboflavin | Sigma-Aldrich | 132350250 | 0.10% |
| Mouse embryonic stem cells | GlobalStem | GSC-5002 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | SH30272.02 | |
| N2 supplement | Invitrogen | 17502048 | 1% |
| FGF2 | Stemgent | 03-0002 | 10 ng/ml |
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Invitrogen | 10010-031 | |
| Resazurin fluorescence dye | Sigma-Aldrich | 62758-13-8 | |
| SV Total RNA Isolation System | Promega | Z3100 | |
| GoScript Reverse Transcription System | Promega | A5000 | |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| Syringe pump | Fisher scientific | 14-831-200 | |
| High voltage power source | Spellman High Voltage Electronics Corporation | SL30 | |
| UV light | Philips | 308643 | 15W/G15T8 |
| Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | ||
| Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600 | Perkin Elmer | 8488 | |
| StepOne Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 |
References
- Migneco, F., Huang, Y. -C., Birla, R. K., Hollister, S. J. Poly (glycerol-dodecanoate), a biodegradable polyester for medical devices and tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 30, 6479-6484 (2009).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R.
- Panunzi, S., De Gaetano, A., Mingrone, G. Approximate linear confidence and curvature of a kinetic model of dodecanedioic acid in humans. American Journal of Physiology-Endocrinology And Metabolism. 289, (2005).
- Park, S., et al. Apparatus for preparing electrospun nanofibers: designing an electrospinning process for nanofiber fabrication. Polymer Internationa l. 56, 1361-1366 (2007).
- Barnes, C. P., Sell, S. A., Boland, E. D., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Nanofiber technology: designing the next generation of tissue engineering scaffolds. Advanced drug delivery reviews. 59, 1413-1433 (2007).
- Li, W. -J., Mauck, R. L., Tuan, R. S. Electrospun nanofibrous scaffolds: production, characterization, and applications for tissue engineering and drug delivery. Journal of Biomedical Nanotechnology. 1, 259-275 (2005).
- Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: a review. Tissue engineering. 12, 1197-1211 (2006).
- Lim, S. H., Mao, H. -Q. Electrospun scaffolds for stem cell engineering. Advanced drug delivery reviews. 61, 1084-1096 (2009).
- Lowery, J. L., Datta, N., Rutledge, G. C. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly (epsilon-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials. 31, 491-504 (2010).
- Tillman, B. W., et al. The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction. Biomaterials. 30, 583-588 (2009).
- Ju, Y. M., Choi, J. S., Atala, A., Yoo, J. J., Lee, S. J. Bilayered scaffold for engineering cellularized blood vessels. Biomaterials. 31, 4313-4321 (2010).
- McCullen, S. D., et al. In situ collagen polymerization of layered cell-seeded electrospun scaffolds for bone tissue engineering applications. Tissue Engineering Part C: Methods. 16, 1095-1105 (2010).
