La estimulación de citoplasmáticos de ADN Sensing Pathways<em> In Vitro</em> Y<em> En Vivo</em
Summary
El objetivo del protocolo es utilizar métodos óptimos para estimular las vías de detección de ADN citoplasmáticos en células e in vivo. Esto se logra mediante la mejora de la generación de ADN de largo, de doble cadena durante la ligadura de extremos romos. Las células o ratones se transfectaron a continuación usando un reactivo de transfección de lípidos.
Abstract
Con el fin de estimular eficazmente una respuesta inmune innata, el ADN debe ser de longitud suficiente y pureza. Se presenta un método donde el ADN de doble cadena (dsDNA), que tiene las características necesarias para estimular el ADN citoplásmico vías sensoriales pueden generarse de forma barata y con facilidad. Por el concatemerization de oligonucleótidos cortos, sintéticos (que carecen de motivos CpG), dsDNA se puede generar a ser de longitud suficiente para activar el citosólica vía de detección de ADN. Este protocolo implica ligación de extremos romos de los oligonucleótidos en presencia de polietilenglicol (PEG), que proporciona un entorno eficaz para la ligadura que se produzca. Los concatemers dsDNA se pueden utilizar, después de la purificación por extracción con fenol / cloroformo, para simular la respuesta inmune innata in vitro por los protocolos de transfección estándar. Este ADN se puede utilizar también para estimular la inmunidad innata en vivo por inyección intradérmica en el pabellón de la oreja de un ratón, por ejemplo. Porestandarizar el proceso de concatemerization y los protocolos de estimulación posteriores, una activación fiable y reproducible del sistema inmune innato puede ser producido.
Introduction
El ADN es un componente vital de todos los organismos y las células eucariotas, que mantienen en compartimentos específicos. Una función del sistema inmune innato es identificar cuando tal compartimentación se rompe o cuando el material extraño se introduce en el organismo a través de un incumplimiento de las barreras físicas, externos. En el cuerpo humano hay una serie de proteínas que existen para ayudar a degradar pequeñas cantidades de ADN que puede escapar de la compartimentación correcta; DNAsa I, II, y III quiebro de ADN en el plasma, endosoma, y el citosol, respectivamente. Sin embargo, se ha demostrado que los ratones que carecen de ADNasa II mueren a causa de la anemia grave causada por una producción excesiva de los interferones 1 que sugieren que el sistema inmune innato responde a ADN extra-nuclear. Esta respuesta se produce incluso en ratones que son completamente deficientes en la capacidad de señalización de los receptores Toll-like. Numerosos estudios han demostrado que la estimulación de genes de interferón (STING) 2 y vinculante TANK-quinasa 1 (TBK1) 3 están involucrados en la detección de ADN en el citoplasma y que esta vía de señalización activa el factor regulador de interferón (IRF) -3 4. La transcripción dependiente de IRF3 subsiguiente de citoquinas, quimioquinas, y los genes de interferón es característica de una respuesta inmune innata a ya sea un patógeno o peligro asociado patrón molecular (PAMP o DAMP) 5.
El deseo de estudiar las vías de detección de ácidos nucleicos intracelulares ha llevado a la necesidad de desarrollar métodos robustos y reproducibles para estimular las células mediante la introducción de ADN o ARN en las células sin activar otras respuestas inmunes innatas. Un método por el cual la picadura / TBK1 / vía IRF3 pueden ser estimulados es mediante el uso de lípidos catiónicos reactivos de transfección para entregar ácido nucleico en el citoplasma, donde se puede acceder por los sensores de ADN tales como ADN-PK, IFI16, y cgas 6-8.
Las características de ADN que se entienden actualmente para permitir effciente activación de la respuesta inmune innata citoplasmática sin estimulación de otras vías son de su longitud, la masa, la pureza, y la falta de motivos CpG 4,7,9. Los oligonucleótidos sintéticos son muy adecuados para el propósito de generar una respuesta inmune innata, ya que permiten la secuencia de ADN para ser optimizado y se preparó como una especie química pura. Un ADN (ISD) secuencia de inmuno-estimuladoras 45 pares de bases fue identificado por Stetson et al. 4 como una secuencia adecuada, CpG-libre para este propósito. Esta secuencia de ADN de doble cadena es de otra manera aleatoria y no tiene características específicas más allá de su falta de motivos CpG. Hemos encontrado que por concatemerizing el oligonucleótido ISD en hebras significativamente más largos aumenta la magnitud de la estimulación 7. Generación de ISD concatemerized tanto, es útil para estimular una respuesta inmune innata citoplasmática. Aquí presentamos los protocolos para la preparación de este reactivo y cómo se puede utilizar para activar la vía de detección de ADN envitro, así como in vivo.
NOTA: Todos los estudios con animales se realizan bajo protocolos institucionales aprobados y las directrices de cuidado de animales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos descritos aquí se utilizan para generar ADN de doble cadena para estimular la respuesta inmune innata citosólica con resultados reproducibles en una amplia gama de tipos de células e in vivo. Dado que el principal reactivo sustrato utilizado es un oligonucleótido sintético, hay flexibilidad en este sistema para el uso de secuencias de ADN alternativas o modificaciones químicas. Es posible, por ejemplo, para reemplazar el oligonucleótido cadena directa descrito en este protocolo con uno que…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| Forward Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | |
| Phenol:Chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel loading buffer | New England biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
| 30G needles | BD bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
| First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
Riferimenti
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