استرجاع الجراحية، عزل و<em> في المختبر</em> توسيع الأمامي الإنسان الصليبي الخلايا المشتقة من الرباط لتطبيقات هندسة الأنسجة
Summary
للتطبيقات المستقبلية بمثابة التصحيح لإصلاح الدموع الجزئي للالرباط المتصالب الأمامي (ACL)، تم عزل ACL الإنسان الخلايا المشتقة من الأنسجة التي تم الحصول عليها خلال إجراءات ترميمية، وسعت في المختبر، ونمت على الأنسجة المهندسة والسقالات. ثم تم إجراء التصاق الخلوية والتشكل لتأكيد توافق مع الحياة على سطح السقالة.
Abstract
إصابة في الرباط الصليبي الأمامي هي مشكلة واجهت شيوعا في الأفراد الناشطين. حتى الدموع جزئية من هذا داخل المفصل في اربطة الركبة تؤدي إلى أوجه القصور التي تعوق النشاط الحيوي وظيفة والاستقرار. الخيارات الحالية لعلاج الدموع ACL جزئية تتراوح بين اللاجراحي، وإدارة المحافظ إلى خيارات جراحية متعددة، مثل: التعديل الحرارية، وإصلاح واحد حزمة والتعمير كاملة، وإعادة بناء الجزء التالف من الرباط الأصلي. دراسات قليلة، إن وجدت، وقد أثبتت أي طريقة واحدة لإدارة لتكون متفوقة على الدوام، وفي كثير من الحالات تستمر المرضى لإثبات عدم الاستقرار المستمرة و comorbidities الأخرى.
الهدف من هذه الدراسة هو تحديد مصدر الخلايا المحتملة لاستخدامها في وضع التصحيح الأنسجة المهندسة والتي يمكن تنفيذها في إصلاح من ACL ممزقة جزئيا. وقد تم تطوير بروتوكول رواية لتوسيع الخلايا المشتقة من patieاليلة تمر بمرحلة إعادة البناء ACL. لعزل الخلايا، والأنسجة هضمها مفروم hACL تم الحصول عليها أثناء إعادة البناء ACL في حل كولاجيناز. تم تنفيذ التوسع باستخدام DMEM/F12 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين (P / S). ثم تم تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل في تجميد المتوسطة التي تتكون من DMSO، FBS ومتوسطة التوسع. بعد ذوبان الجليد، ثم تم المصنفة الخلايا المشتقة hACL على الأنسجة المهندسة السقالة، PLAGA (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك بولي) والسيطرة الأنسجة الثقافة البوليسترين (برنامج التعاون الفني). بعد 7 أيام، تم تنفيذ SEM لمقارنة التصاق الخليوي الى PLAGA مقابل مشروعات برنامج التعاون الفني السيطرة. تم تقييم مورفولوجيا الخلوية باستخدام المناعي تلطيخ. أظهرت SEM (المسح المجهر الإلكتروني) الميكروسكوب أن الخلايا نمت والالتزام على حد سواء PLAGA وبرامج التعاون الفني والأسطح ومتموجة فوق السطوح بعد يوم كامل 7. أظهرت المناعي تلطيخ العادي، غير المورفولوجي شددأنماط القاعدة على كل السطوح. هذه التقنية واعدة للتطبيقات في دوري أبطال آسيا التجديد وإعادة البناء.
Introduction
الرباط الصليبي الأمامي (ACL) هو جرح عادة الرباط داخل المفصل في الركبة. يتم الإبلاغ عن حوالي 200،000 (ACL) إصابات سنويا في الولايات المتحدة. أكثر من 75٪ من مرضى الذين يعانون من إصابة الرباط الصليبي الأمامي تختار لجراحة العظام 1،2،3،4. وكثيرا ما أشار التدخل الجراحي نظرا لإمكانات الشفاء الفقراء بطبيعتها 3. وعادة ما يتم إنجاز إعادة البناء ACL عن طريق لطعم ذاتي أو طعم خيفي وتر. طعم ذاتي وطعم خيفي تمثل المعيار الذهبي لإعادة الإعمار كما تباهى معدلات نجاح عالية، وإصلاح خياطة الأولية، خيار العلاج الأخرى، وقد أظهرت معدلات فشل تصل إلى 94٪ 5،6،7.
الدموع الجزئي للACL تمثل 10٪ إلى 28٪ من كل الدموع ACL 8. في دراسة استطلاعية، نويس وآخرون يقدر أن 50٪ من المرضى الذين يعانون من الدموع الجزئي التي تؤثر على أكثر من نصف دوري أبطال آسيا تقدما لاستكمال دوري أبطال آسيا بعد عدم كفاية غيرالمعالجة الجراحية 9. وتبلغ دراسات أخرى عدم الاستقرار المستمرة وانخفاض وظيفة مع أقل من 30٪ من المرضى قادرين على العودة إلى ما قبل الإصابة مستوى النشاط 9،10،11،12،13. خيارات العلاج محدودة وتشمل طرائق المحافظة، وانكماش الحراري المتبقية ACL، أو إعادة بناء الرباط الصليبي الأمامي. في الآونة الأخيرة، كانت هناك زيادة في الاهتمام في إصلاح الأساسي المعزز. استخدام هذه التقنيات البيولوجية لتعزيز الإصلاحات خياطة الابتدائية 14. وقد حاولت البحوث الحديثة لحصاد مثل الوسيطة hACL الخلايا الجذعية المشتقة للتحايل على القيود الكسب غير المشروع، ولكن 31،32 صلاحية وفعالية هذه الخلايا لا يزال مجهولا. يبدو أن مصدر خلية مثالية لتطبيقات هندسة الأنسجة لتكون غير mesechymal-hACL المستمدة الخلايا الليفية.
وتركز الأبحاث الحالية على تحديد المواد المصفوفة مناسبة ومصدر الخلية لالسقالة هندسيا. هو الإجراء القياسي لACL ممزقة ليتم التخلص منها كما سوالنفايات rgical أثناء الجراحة إعادة الإعمار، ومع ذلك، قد يكون هذا الرباط التالفة مصدر الجودة لاقتناء الخلايا اللازمة لتطوير وتعزيز والأنسجة المهندسة المثالي استبدال ACL. وقد وضعت لدينا مختبر بروتوكول للتوسع في المختبر من هذه hACL الخلايا المشتقة المقطوع. باستخدام مصفوفة 2D المهندسة يملؤه الخلايا المشتقة hACL، قمنا بتصميم تصحيحا التي يمكن أن تزيد من إصلاح ACL جزئية وتعزيز الأربطة الممزقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان الهدف الأساسي من هذه الدراسة سقالة hACL/2D لاستخدام الخلايا التي تم الحصول عليها في التصحيح لزيادة إصلاح الأولية من الدموع ACL جزئية. إدارة اللاجراحي من الدموع ACL الجزئية قد تشمل فترة قصيرة من الشلل، تستعد، برنامج إعادة التأهيل التدريجي، وتقييمات المتابعة العادية <sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه بدء صندوق وقسم الجراحة منحة بحثية من جامعة جنوب إلينوي، كلية الطب؛ ومنحة مؤسسة ميموريال الطبية.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri-dish | Fisher Scientific | 08-757-103C | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | Store at 40C |
| DMEM/F-12 | Cellgro | 10-092-CV | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10082 | Store at -800C |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | Store at 40C |
| Centrifuge Tubes- 15 ml | Corning | 430790 | |
| T-25 flasks | BD Falcon | 3013 | |
| Trypsin-Versene mixture | Lonza | 17-161E | Store at 40C. Warm in 370C water bath before use. |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | Combustible liquid. Can cause skin, eye and respiratory tract irritation. |
| Cryogenic vials | Corning | 430489 | |
| PLAGA | Purac Biomaterials | Purasorb PLG8523 | Store at -800C |
| TCPS disks | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC36423-0010 | Possible cancer hazard. Store in a dry, cool place. |
| Bytac paper | Saint gobin performance plastics | 1420652 | |
| Scintillation vial | Fisher Scientific | 03-339-21G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Store at 40C |
| Tween | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| mouse Anti-β-actin antibody (10 Ab) | Sigma Aldrich | A5441 | Store at -200C |
| goat-anti-mouse antibody (20 Ab) | Cell Signaling | 4408 | Store at -200C |
| Hoechst dye | Sigma Aldrich | 14530 | Store at -200C |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | BP2547-1 | Toxic by inhalation and if swallowed. Causes burns by all exposure routes. |
| Hexamethyldisilazane | Fisher Scientific | AC43085-1000 | Flammable liquid and vapor. Causes burns by all exposure routes. |
| Sterile Scissors | McKesson | 25-716 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Light Microscope | Olympus | CK40 | |
| Water Bath | Thermo scientific | 2845 | |
| Vortex | Labnet | VX-200 | |
| Glass Petri plates | fisher Scientific | S31473 | |
| Acu-Punch | Acuderm Inc. | P1225 | Acu-Punch was used to cut 12mm disks |
| Cacodylate buffer | Sigma Aldrich | 97068 | Flammable liquid, carcinogen and irritant. |
| Osmium tetraoxide | Sigma Aldrich | 201030 | Highly toxic |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | Harmful if swallowed |
| Ethanol | Decon Labs | 2705 | Keep away from heat, sparks, flame and other form of ignition. |
| General/regional Anesthesia | Amphastar pharmaceuticals | 1% Lidocaine, 0.25% Bupivacaine,Anesthetic agents for induction and maintenance | |
| Antibiotics | Hospira | 0409-0805-01 | Ancef 1g i.v. |
| Arthroscopy trocar | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopy Camera | Smith and Nephew | ||
| Arthroscopic grasper and bitter | Arthrex | ||
| 4.5mm shaver | Arthrex | ||
| Interference Screws | Arthrex | stainless steel screws | |
| Sputter Coater | Polaron | E5400 |
Riferimenti
- Johnson, R. J. The anterior cruciate ligament: A dilemma in sports medicine. Int J Sports Med. 3, 71-79 (1982).
- Owings, M. F., Kozak, L. F. Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996. Vital Health Stats. 13, 1-119 (1998).
- Frank, C. B., Jackson, D. W. The science of reconstruction of the anterior cruciate ligament. J Bone Joint Surg Am. 79, 1556-1576 (1997).
- Miyasaka, K. C., Daniel, D. M., Stone, M. L., Hirshman, P. The incidence of knee ligament injuries in the general population. Am J Knee Surg. 4, 3-8 (1991).
- Taylor, D. C., Posner, M., Curl, W. W., Feagin, J. A. Isolated tears of the anterior cruciate ligament: over 30 year follow-up of patients treated with arthrotomy and primary repair. Am J Sports Med. 37 (1), 65-71 (2009).
- Liljedahl, S. O., Lindvall, N., Wetterfors, J. Early diagnosis and treatment of acute ruptures of the anterior cruciate ligament: a clinical and arthrographic study of forty-eight cases. J Bone Joint Surg Am. 47, 1503-1513 (1965).
- Oensten, M., Lysholdm, J., Gillquist, J. Suture of fresh ruptures of the anterior cruciate ligament: A 5 year follow up. Acta Orthop Scan. 55, 270 (1984).
- Buckley, S. L., Barrack, R. L., Alexander, A. H. The natural history of conservatively treated partial anterior cruciate ligament tears. Am J Sports Med. 17 (2), 221-225 (1989).
- Noyes, F. R., Mooar, L. A., Moorman, C. T., McGinnis, H. G. Partial tears of the anterior cruciate ligament. Progression to complete ligament deficiency. J Bone Joint Surg Br. 71 (5), 825-833 (1989).
- Bak, K., Scavenius, M., Hansen, S., Norring, K., Jensen, K. H., Jorgensen, U. Isolated partial rupture of the anterior cruciate ligament. Long term followup of 56 cases. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (2), 66-71 (1997).
- Fritschy, D., Panoussopoulos, A., Wallensten, R., Peter, R. Can we predict the outcome of a partial rupture of the anterior cruciate ligament? A prospective study of 43 cases. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 5 (1), 2-5 (1997).
- Sommerlath, K., Odensten, M., Lysholm, J. The late course of acute partial anterior cruciate ligament tears. A nine to 15 year follow-up evaluation. Clin Orthop. , 281-2152 (1992).
- Barrack, R. L., Buckley, S. L., Bruckner, J. D., Kneisl, J. S., Alexander, A. H. Partial versus complete acute anterior cruciate ligament tears: the results of nonoperative treatment. J Bone Joint Surg Br. 72 (4), 622-624 (1990).
- Murray, M. M. Current status and potential of primary ACL repair. Clin Sports Med. 28 (1), 51-61 (2009).
- Gupta, A., et al. Single walled carbon nanotube composites for bone tissue engineering. J Orthop Res. 9, 1374-1381 (2013).
- Fruensgaard, S., Johannsen, H. V. Incomplete ruptures of the anterior cruciate ligament. J Bone Joint Surg Br. 71, 526-530 (1989).
- Sandberg, R., Balkfors, B., Nilsson, B., Westlin, N. Operative versus non-operative treatment of recent injuries to the ligaments of the knee. A prospective randomized study. J Bone Joint Surg Am. 69, 1120-1126 (1987).
- Lamar, D. S., Bartolozzi, A. R., Freedman, K. B., Nagda, S. H., Fawcett, C. Thermal modification of partial tears of the anterior cruciate ligament. Arthroscopy. 21 (7), 809-814 (2005).
- Indelli, P. F., Dillingham, M. F., Fanton, G. S., Schurman, D. J. Monopolar thermal treatment of symptomatic anterior cruciate ligament instability. Clin Orthop. 407, 138-147 (2003).
- Smith, D. B., Carter, T. R., Johnson, D. H. High failure rate for electrothermal shrinkage of the lax anterior cruciate ligament: a multicenter follow-up past 2 years. Arthroscopy. 24 (6), 637-641 (2008).
- Buda, R., Ferruzzi, A., Vannini, F., Zambelli, L., Di Caprio, F. Augmentation technique with semitendinosus and gracilis tendons in chronic partial lesions of the ACL: clinical and arthrometric analysis. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 14 (11), 1101-1107 (2006).
- Sekiya, J. K., Golladay, G. J., Wojtys, E. M. Autodigestion of a hamstring anterior cruciate ligament autograft following thermal shrinkage: a case report and sentinel of concern. J Bone Joint Surg Am. 82 (10), 1454-1457 (2000).
- Farquharson-Roberts, M. A., Osborne, A. H. Partial rupture of the anterior cruciate ligament of the knee. J Bone Joint Surg Br. 65, 32-34 (1983).
- Rue, J. P., Ghodadra, N., Bach, B. R. Femoral tunnel placement in single-bundle anterior cruciate ligament reconstruction: a cadaveric study relating transtibial lateralized femoral tunnel position to the anteromedial and posterolateral bundle femoral origins of the anterior cruciate ligament. Am J Sports Med. 36, 73-79 (2008).
- Carey, J. L., Dunn, W. R., Dahm, D. L., Zege, S. L., Spindler, K. P. A systematic review of anterior cruciate ligament reconstruction with autograft compared with allograft. J Bone Joint Surg. 91, 2242-2450 (2009).
- Murray, M. M., Martin, S. D., Martin, T. L., Spector, M. Histological changes in the human anterior cruciate ligament after rupture. J Bone Joint Surg Am. 82, 1387-1397 (2000).
- Andrish, J., Holmes, R. Effects of synovial fluid on fibroblasts in tissue culture. Clin Orthop Relat Res. (138), 279-283 (1979).
- Murray, M. M., Spindler, K. P., Ballard, P., et al. Enhanced histologic repair in a central wound in the anterior cruciate ligamentwith a collagen-platelet-rich plasma scaffold. J Orthop Res. 25, 1007-1017 (2007).
- Carter, T. R. Anterior cruciate ligament thermal shrinkage. Clin Sports Med. 21, 693-700 (2002).
- Perry, J. J., Higgins, L. D. Anterior and posterior cruciate ligament rupture after thermal treatment. Arthroscopy. 16, 732-736 (2000).
- Cheng, M. T., Yang, H. W., Chen, T. H., Lee, O. K. Isolation and characterization of multipotent stem cells from human cruciate ligaments. Cell Prolif. 42 (4), 448-460 (2009).
- Matsumoto, T., et al. Isolation and characterization of human anterior cruciate ligament-derived vascular stem cells. Stem Cells Dev. 21 (6), 859-872 (2012).
