הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Summary

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

Abstract

חלבוני ערוץ יון הם מכשירים אוניברסליים לתקשורת מהירה על פני ממברנות ביולוגיות. החתימה הזמנית של השטף היוני הם מייצרים תלויה במאפיינים פנימיים לכל חלבון ערוץ, כמו גם את המנגנון שבאמצעותו הוא נוצר ונשלט ומייצגת תחום חשוב של מחקר הנוכחי. ניתן להשיג מידע על הדינמיקה התפעולית של חלבוני תעלת יונים על ידי התבוננות פרקי זמן ארוכים של זרם המיוצרים על ידי מולקולה בודדת. שתואר כאן הוא פרוטוקול להשגת הקלטות אחד ערוצים מצורפים תא התיקון-clamp הנוכחיות לערוץ יגנד מגודרת יון, הקולטן NMDA, הביע heterologously בHEK293 תאים או באופן מקורי בתאי עצב בקליפת המוח. גם סיפקו הוראות כיצד להתאים את השיטה לתעלות יונים אחרות של עניין על ידי הצגת הדוגמא של PIEZO1 ערוץ מיכני רגיש. שיטה זו יכולה לספק נתונים לגבי מאפייני המוליכות של הערוץ ואת הרצף הזמני של אופתצורות n-סגורים המרכיבות את מנגנון ההפעלה של הערוץ, ובכך לסייע להבנת תפקודם בבריאות ובחוליים.

Introduction

תקשורת מהירה על פני ממברנות ביולוגיות מסתמכת כמעט אך ורק על חלבוני oligomeric נקבוביות ויוצר קרום, המכונות גם ערוצים. חלבונים אלה שונים באופן נרחב באותות הפעלה, מנגנוני gating, ומאפייני מוליכות. חלבוני ערוץ נקבוביות שהם סלקטיבית ליוני מסווגים כתעלות יונים; ההפעלה שלהם מייצרת זרמים יוניים על פני הקרום, והתגובות שלהם יכולות להיות מוקלטות עם רזולוציה גבוהה בזמן אמת תוך שימוש בטכניקות אלקטרו. אותות ההפעלה span מגוון רחב של תשומות כימיות ופיזיות הכוללים מילויים ריכוז, כוחות מכאניים וחשמליים, וטמפרטורה; וכך, סיווג נוסף תעלות יונים ליגנד מגודרת, mechanosensitive, מתח מגודרת, או סוגים רגישים לחום. במאמר זה, פרוטוקולים מתוארים להקליט פעילות אחד ערוצים מערוץ יגנד מגודרת, הקולטן NMDA, וערוץ mechanosensitive, PIEZO1, תוך שימוש בטכניקת תיקון מהדק.0;

אלקטרופיזיולוגיה תיקון מהדק היא השיטה הניסיונית הראשונה והנפוצה ביותר רגישה מספיק כדי לאפשר התצפית של מולקולות בודדות ^{1, 2.} בנוסף לרגישות המעודנת זה, היא הרחיבה במידה רבה את ההכנות ביולוגיות ניתנות להקלטת אלקטרו וגם אפשרה התצפית של תעלות יונים בקרומים שלמים. ראשית, משום ששניהם הידוק המתח והקלטה נוכחית הם השיגו עם אותו אלקטרודה, ניתן להשתמש בו כדי להקליט את האותות פני תאים קטנים או תיקוני ממברנות. הטכניקה גילתה כי תעלות יונים אינן מוגבלות לממברנות להתרגש של שרירי צפרדע, electroplaques צלופח, או אקסונים ענק דיונון ^{3, 4,} אלא שהם מייצגים גופי בכל מקום של מנגנוני איתות הטרנסממברני ומהותיים לכל סוגי קרום התא של חד או אורגניזמים רב תאיים, וגם לקרומים תאיים. יבואantly, היכולת להקליט זרמים הטרנסממברני פשוט על ידי חיבור פיפטה זכוכית לתא שלם סיפקה את ההזדמנות חסרת תקדים להקליט פעילות מתעלות יונים בקרום בלא ההפרעה האם שלהם. לכן, טכניקת התא המצורפת תיקון מהדק, אשר מתוארת בפרוטוקול זה, מאפשרת ניטור הפעילות של תעלות יונים ברציפות במשך עשרות דקות או יותר בסביבה הטבעית שלהם.

על פי תנודות תרמיות נורמליות, כל החלבונים, כוללים חלבוני ערוץ יון, לעבור שינויים מבניים על פני זמן בקנה מידה רחבה, עם השחלופים המהירים ביותר והשכיח ביותר ייצגו ככל הנראה על ידי תנועות בצד שרשרת ושינויים הרבה יותר איטיים, פחות תכופים מיוצגים על ידי מיקום מחדש של כל תחומים או יחידות משנה, או במקרים מסוימים על ידי שינויים שלאחר translational או אינטראקציות בין חלבונים ^{5, 6.} התבוננות תקופות ארוכות של פעילות שנוצרו על ידי מולקולה אחת יכולה לעזור להבין את התפקודדינמיקה תזונתית של תעלות יונים בקרום פיסיולוגי שלם ומספקת מידע רב ערך על המנגנון המבצעי של המולקולה שנצפתה.

בניגוד להבנה הגדלה והולכת של הגיוון של תעלות יונים על פני סוגי תאים ושלבי התפתחות, ידע על ההרכב המולקולרי של תעלות יונים בקרום ילידים עדיין מוגבל. כל תעלות היונים הן חלבוני Multimeric ורוב תעלות יונים האם להרכיב ממספר סוגים של תת יחידות ייצור חלבונים של גיוון מולקולרי רחב, אשר לעתים קרובות מלווה עם תכונות מוליכות וgating מגוונות. מסיבה זו, תעלות יונים של הרכב מולקולרי מוגדר נלמדות על ביטוי במערכות Heterologous. בפרט, HEK293 תאים, שהם קו משובט של תאים עובריים אנושיים הונצחו בכליות ^7, זכו בהכרה נרחבת כמערכת המועדפת לביטוי Heterologous של תעלות יונים רקומביננטי. בין האדםיתרונות y שהעלו HEK293 תאים כמערכת הבחירה לאלקטרופיזיולוגיה ערוץ יון הם את הקלות ואת affordability של culturing ושמירה על תרבויות יציבים חיים ארוכות, את היכולת שלהם לבצע קיפול לאחר translational, עיבוד וסחר של חלבוני יונקים, ובמקרים רבים , רמתם הנמוכה או אפילו העדר ביטוי אנדוגני לערוץ של עניין ^{7, 8.} להביע תעלות יונים רקומביננטי ולומדים את מאפייני הפעילות שלהן בתאי HEK293 ממשיך להיות גישה רבת ערך לקבלת מידע על נכסי מבנה לתפקוד של תעלות יונים, כמו גם את המאפיינים הספציפיים של isoforms ערוץ יון ואת תפקידם ברקמות מקומיות. הפרוטוקולים מתוארים במאמר זה יכול להיות מיושמים באופן שווה גם לתעלות יונים רקומביננטי המתבטאות בתאי HEK293 ולתעלות יונים ילידים.

לסיכום, טכניקת תיקון מהדק, באמצעות היכולת חסרת תקדים שלה כדי לפתור אותים ממולקולה אחת נותר, עד כה, השיטה הישירה ביותר להתבוננות בהתנהגות של מולקולות בודדות. במצב מחובר התא שלה, הקלטת התיקון-clamp מאפשרת תצפית תקופות ארוכות אשר, כאשר נעשה למולקולה אחת, יכול לספק תובנה יוצאת דופן לפעילות של תעלות יונים. להלן מוצג פרוטוקול להשגת הקלטות הנוכחיות ברזולוציה גבוהה מתיקונים מצורפים תא המכילים חלבון ערוץ יון אחד.

Protocol

1. ביטוי תרבית תאים וחלבונים שמור על תאי HEK293 (מספר ATCC CRL-1573) בין הקטעים 22 ו40, הכולל קטעים שבוצעו על ידי ATCC, בתרבות monolayer DMEM בתוספת 10% שור סרום עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין בתערובת 5% CO 2 ו37 ° C. בין ניסויים, תאי מעב…

Representative Results

רקומביננטי NMDA רצפטורים קולטני NMDA להיקשר ולהגיב לפעולה במקביל של שני עמיתים לאגוניסטים: גלוטמט וגליצין. הם להרכיב כheterotetramers של שני גליצין המחייב יחידות משנה GluN1 ושני גלוטמט מחייב יחידות משנה GluN2. יחידות משנה GluN2 מקודדות ע?…

Discussion

בתחום ערוץ יון, אזור חשוב של מחקר מוקדש להבנת רצף אירועים שמוביל לערוץ פתיחה או מנגנון gating של הערוץ. עבור רוב הערוצים, תהליך זה הוא מורכב וכולל מספר שלבים הקינטית שלא ניתן להסיק מאות רב ערוצים מקרוסקופית. לעומת זאת, יכולים להיות מתוכננים ניסויים שבם התבוננות רצף אירוע…

Materials

Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1×51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1