Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Summary

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Abstract

Proteínas de los canales iónicos son dispositivos universales para la comunicación rápida a través de membranas biológicas. La firma temporal del flujo iónico que generan depende de las propiedades intrínsecas a cada proteína del canal, así como el mecanismo por el cual se genera y se controla y representa un área importante de la investigación actual. Información acerca de la dinámica de funcionamiento de proteínas de los canales de iones se puede conseguir mediante la observación de largos tramos de corriente producida por una única molécula. Descrito aquí es un protocolo para la obtención de patch-clamp grabaciones de corriente de la célula-adjunto de un canal para un canal de iones cerrada ligando, el receptor de NMDA, expresado de forma heteróloga en células HEK293 o de forma nativa en las neuronas corticales. También se proporcionan instrucciones sobre cómo adaptar el método a otros canales iónicos de interés al presentar el ejemplo del canal PIEZO1 mecano-sensible. Este método puede proporcionar datos con respecto a las propiedades de conductancia del canal y la secuencia temporal de Opeconformaciones n cerrados que componen el mecanismo de activación del canal, lo que ayuda a comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.

Introduction

Comunicación rápida a través de membranas biológicas depende casi exclusivamente de las proteínas de membrana oligómeros formadores de poros, comúnmente conocidos como canales. Estas proteínas son muy diferentes en las señales de activación, los mecanismos de activación periódica y propiedades de conductividad. Proteínas de los canales cuyos poros son selectivos para iones se clasifican como canales iónicos; su activación produce corrientes iónicas a través de la membrana, y sus respuestas se puede grabar con alta resolución en tiempo real utilizando técnicas electrofisiológicas. Las señales de activación abarcan una amplia gama de insumos químicos y físicos, incluyendo gradientes de concentración, las fuerzas mecánicas y eléctricas y la temperatura; por lo tanto, la clasificación más canales iónicos en ligando cerrada, mechanosensitive, voltaje cerrados o tipos sensibles al calor. En este artículo, se describen protocolos para registrar la actividad de un canal de un canal de ligando cerrada, el receptor de NMDA, y un canal de mechanosensitive, PIEZO1, utilizando la técnica de patch-clamp.0;

Electrofisiología Patch-clamp es el primer y más utilizado método experimental suficientemente sensible para permitir la observación de moléculas individuales ^{1, 2.} Además de esta exquisita sensibilidad, que se ha expandido enormemente las preparaciones biológicas susceptibles de grabación electrofisiológico y también ha permitido la observación de los canales iónicos en membranas intactas. En primer lugar, debido a que ambos de fijación de tensión y de grabación actual se llevan a cabo con el mismo electrodo, que puede ser utilizado para grabar señales a través de células pequeñas o parches de membranas. La técnica reveló que los canales iónicos no se restringen a las membranas excitables de músculos rana, electroplaques anguila, o axones gigantes del calamar ^{3, 4,} sino que representan accesorios ubicuos de los mecanismos de señalización transmembrana y son intrínsecas a todos los tipos de membranas celulares de uni-o los organismos multicelulares, y también a las membranas intracelulares. Importaciónantly, la capacidad para registrar las corrientes transmembrana con sólo conectar una pipeta de vidrio de una célula intacta proporcionó la oportunidad sin precedentes para registrar la actividad de los canales iónicos en las membranas ininterrumpido nativas. Así, el adjunto técnica de patch-clamp de células, que se describe en este protocolo, permite el seguimiento de la actividad de los canales iónicos de forma continua durante decenas de minutos o más en su ambiente nativo.

Bajo las fluctuaciones térmicas normales, todas las proteínas, incluyendo las proteínas de los canales iónicos, sufren cambios estructurales a lo largo de una escala de tiempo amplio, con los reordenamientos más rápidos y más frecuentes representados muy probablemente por los movimientos de las cadenas laterales y los cambios mucho más lentos y menos frecuentes representados por el reposicionamiento de toda dominios o subunidades, o en algunos casos por modificaciones post traduccionales o interacciones proteína-proteína ^{5, 6.} Observando largos periodos en actividades generadas por una molécula puede ayudar a comprender la funcióndinámicas internacionales de los canales iónicos en las membranas intactas fisiológicos y proporciona información valiosa sobre el mecanismo de funcionamiento de la molécula observado.

En contraste con la creciente comprensión de la diversidad de los canales de iones a través de tipos de células y etapas de desarrollo, el conocimiento sobre la composición molecular de los canales iónicos en membranas nativas es aún limitada. Todos los canales de iones son proteínas multiméricas y la mayoría de los canales de iones nativos ensamblan a partir de varios tipos de subunidades que producen proteínas de diversidad molecular amplia, que a menudo se acompaña con diversas propiedades de conductancia y de activación periódica. Por esta razón, los canales iónicos de composición molecular definido se estudiaron después de la expresión en sistemas heterólogos. En particular, las células HEK293, que son una línea clonal de células embrionarias humanas inmortalizadas de riñón ^7, ganado amplia aceptación como el sistema preferido para la expresión heteróloga de los canales iónicos recombinantes. Entre el hombreY ventajas que elevaron las células HEK293 como el sistema de elección para la electrofisiología de canales de iones son la facilidad y asequibilidad de cultivo y mantener los cultivos estables de larga duración, su capacidad para llevar a cabo después de la traducción de plegado, el procesamiento y el tráfico de proteínas de mamíferos, y en muchos casos , su bajo nivel o incluso ausencia de la expresión endógena para el canal de interés ^{7, 8.} Expresando los canales iónicos recombinantes y estudiar sus propiedades funcionales en células HEK293 sigue siendo un enfoque valioso para obtener información sobre las propiedades de estructura-función de los canales iónicos así como las propiedades específicas de las isoformas de los canales iónicos y sus roles en el tejido nativo. Los protocolos que se describen en este artículo se pueden aplicar igualmente a los canales iónicos recombinantes expresadas en células HEK293 y para los canales iónicos nativas.

En resumen, la técnica de patch-clamp, a través de su capacidad sin precedentes para resolver señals de una molécula sigue siendo, hasta la fecha, el método más directo para observar el comportamiento de las moléculas individuales. En su modo celular conectado, la grabación de patch-clamp permite períodos largos de observación que, cuando se hace por una molécula, pueden proporcionar una visión excepcional sobre el funcionamiento de los canales iónicos. A continuación se presenta un protocolo para la obtención de alta resolución grabaciones actuales de parches adjuntos de células que contienen una proteína de canal iónico.

Protocol

1. Cultivo Celular y Expresión de proteínas Mantener las células HEK293 (número de ATCC CRL-1573) entre los pasajes 22 y 40, que incluye pasajes realizados por la ATCC, en cultivo en monocapa en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina a la mezcla de 5% de CO 2 y 37 ° C. Entre los experimentos, las células de paso en matraces T25 a 5-20 diluciones en un volumen final de 10 ml. Nota: El uso de células durante estos pasajes garantiza la salud ce…

Representative Results

Recombinante receptores NMDA Los receptores NMDA se unen y responden a la acción simultánea de dos co-agonistas: glutamato y glicina. Se reúnen como heterotetrámeros de dos subunidades de unión a glicina GluN1 y dos glutamato vinculante subunidades GluN2. GluN2 subunidades están codificadas por cuatro genes (AD) y de éstos las formas más ampliamente transcritas en el cerebro son GluN2A en adultos y GluN2B en animales jóvenes. Debido a la diversidad de los subtipos d…

Discussion

En el campo de los canales iónicos, un área importante de la investigación se dedica a la comprensión de la secuencia de acontecimientos que conduce al canal de apertura o mecanismo de compuerta del canal. Para la mayoría de los canales, este proceso es complejo e implica varios pasos cinéticos que no se puede deducir a partir de una señal multicanal macroscópica. Por el contrario, los experimentos pueden ser diseñados, donde la observación de la secuencia de los eventos de apertura / cierre en el registro de …

Materials

Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1×51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1