Summary
引入小分子到显影果蝇胚胎提供了用于表征的新化合物，药物和毒素的生物活性，以及用于探测基本发育途径的巨大潜力。本文所述的方法概括了战胜自然障碍，这种做法，扩大了果蝇胚胎模型的实用步骤。
Abstract
果蝇胚胎一直是强大的实验室模型，以求澄清该控制发展的分子和遗传机制。遗传操作这一模式的易用性已经取代药物的方法是司空见惯的其他动物模型和基于细胞的检测。在这里，我们描述了一个协议，它使应用小分子显影果蝇胚胎的最新进展。该方法详细步骤，克服了蛋壳的抗渗性，同时保持胚胎的生存能力。在广泛发育阶段的蛋壳通透性是由应用程序先前描述的d-柠檬烯胚胎透溶剂（EPS 1），并通过老化胚胎在降低的温度（18°C）前处理实现的。此外，利用一个远红染料（CY5）作为透化指示剂进行了说明，这是与涉及标准的红，绿流感下游应用兼容orescent染料在现场和固定的准备。该协议适用于使用生物活性化合物来探测发育机制以及为研究旨在评估未知的小分子致畸或药理活性的研究。
Introduction
果蝇胚胎仍然是一个首要的模型为开发2基本机制的调查。是通过允许基本上任何基因操作在任何时间点，并在所有发展中的器官的分子遗传工具的广泛支持这一强大的模型。小尺寸的果蝇胚胎的形态发生，发展迅速，广泛的特性使其成为首选的遗传筛选，其中许多已经发现根本发展途径3,4模型。在果蝇胚胎大量的表型进行了表征，并容易解释，往往提供确定负责异常性状潜在的分子遗传机制的一种手段。
从历史上看，在果蝇胚胎模型的一个缺点一直是引入小分子对胚胎组织的难度。这一障碍已对限制：1）我们ING已知的生物活性小分子作为探针询问发育机制以及2）使用这个既定的模型来评估未知的小分子致畸或药理活性。作为结果，在果蝇胚胎的筛选潜力已经得到充分利用的小分子活性的表征。
1）透蛋壳和2）显微注射：输送小分子的果蝇胚胎可以用两种方法来实现。本文介绍了，很容易在传统的果蝇实验室的设置来执行垫款通透的方法。但应注意的是，在微注射方法，与微流体技术的最新进展也有助于引入化合物对胚胎5,6的方法。将分子引入到胚胎是防止由蛋壳7的蜡质层。 果蝇蛋壳由五层组成。从内向外它们是：卵黄膜，蜡质层，内层绒毛膜层，endochorion和exochorion 8。三个外绒毛膜层可以通过在稀释的漂白胚胎的简要再现被去除，步骤简称为dechorionation。暴露的蜡质层然后可以通过暴露于有机溶剂，如庚烷和辛烷7,9，渲染dechorionated胚胎可渗透受到损害，而它仍然装在底层卵黄膜。然而，使用这些溶剂中的介绍，由于其毒性和对调节其强透化作用，这两者都在胚胎存活率9,10鲜明的负面影响的难度复杂化。
通透的使用成分称为胚胎透溶剂（EPS）的一种方法，以前已经描述1。这种溶剂包括d-柠檬烯和植物衍生的表面活性剂，使溶剂是misciblE使用水性缓冲液。 d-柠檬烯和溶剂稀释至所需浓度的能力的低毒屈服于产生渗透胚胎具有高生存能力1的有效方法。然而，有两个内源性因素继续带来限制的应用程序。首先，胚胎表现出异质性，透气性后每股收益处理，即使小心地保持着密切的发育分期。其次，胚胎早于约8小时已被证明难以通透，与后产蛋11时发生的蛋壳硬化一致。
这里描述的是在EPS方法的进展：1）协助查明和分析近透完全相同的胚胎，即使在固定和染色步骤已经执行，2）使胚胎的通透性在后期发育时间点（> 8小时，阶段12岁及以上）。具体地，应用一个远红染料，CY5羧酸，记载了作为透气性指标，它在开发过程中和甲醛固定后仍然存在于胚胎。此外，它表明，在18℃下培育的胚胎保持在蛋壳的EPS敏感的状态，使后期的胚胎（12-16级）的通透性。
这些进步克服了前面提到的限制，对EPS的方法。因此，该应用程序将提供与调查，介绍景点小分子胚胎在不同的发育时间点，同时保持活力的一种手段。
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Protocol
1，飞文化，解决方案和胚胎处理装置的研制
- 准备果蝇的网箱养殖。放置500 +配合所需的应变的苍蝇在装有10cm的葡萄琼脂平板和酵母膏的点群的笼子。在25°C湿度控制培养箱中保持文化。注意： 凯奇文化需要一天的调理或两个获得一致的胚胎铺设图案。葡萄板的酵母膏是一次在早晨，一次在晚上调理过程中改变。
- 准备的EPS。表面活性剂（椰油酰胺DEA和乙氧基化醇），在37℃暖解决方案移液器18毫升d-苎烯的一种玻璃闪烁瓶中装有一个小的搅拌棒。移液器各2表面活性剂（每5％的最终浓度）为1毫升的d-苎烯。调匀，取出搅拌棒。注：此股票的EPS解决方案是好的约2个月室温。该解决方案应在37℃下被加热并旋动至完全溶解，使用前的表面活性剂。 EPS和d-苎烯，应存储在一个玻璃容器，因为它们会溶解某些塑料随着时间的推移。
- 准备胚胎dechorionation解决方案，孵化介质，染料和药物的解决方案。混合25毫升漂白剂用25毫升H 2 O和发生在浅盘。按照现有配方1,12制备改性的基本培养液（MBIM）和MBIM-T。制备盾并根据制造商的方案相M3细胞培养基和PBS（见材料清单）。准备通透性染料原液在10 mM的浓度在DMSO中。
- 组装胚胎处理设备及用品：
- 准备dechorionation和EPS治疗篮（ 见图1A）。切断一次性50毫升聚丙烯离心/文化管细齿锯的3厘米部分。使焊接表面齐平摩擦砂纸上的管段坚持到台式表面。焊接管部到Nitex尼龙筛通过熔化筒部的周缘在火焰和按压到网格上的玻璃板。晾凉剪掉多余的网格。注：纯粹的两侧和底部以便迅速而完全冲洗掉残余漂白剂和每股收益的各个步骤。 焊接步骤应在通风橱中进行。
- 准备开发篮子。切断一个50ml的离心/培养管与盖的边缘齐平的顶部。除去并通过切出沿轮辋的中心孔和切口， 如图1B所示修改的上限。螺丝帽在网和在切断管段的线程和修剪多余的网格。注：上限包含在允许扩散到大型媒体定位在60毫米储菜（ 图1B'）时，边缘的缺口。
- 准备一个滑动室的部件。切DO膜的平方即大于滑动室开幕。适用于非常薄的层的真空润滑脂与开口的内唇缘。贴上DO膜进入封口它反对用挡圈油脂。通过削减其背部紧贴固定环修剪多余的DO膜。注：规格为滑动室可以在Kiehart 等[13]发现这个房间是不是市场上买到，由机加工车间需要定制加工。
2，分期，Dechorionation和胚胎的EPS治疗
- 通过定时采集分期胚胎。设置一个新鲜葡萄/酵母板飞文化笼中的PM。允许在25℃下敷设1小时的胚胎放弃这个板块，并与新鲜的葡萄/酵母板在25°C取代2小时的后续发育铺设收集这些板块和地点在18℃培养箱中进一步发育分期。注：1小时发展在25°C等于2小时发展在18°C。在18℃下维持盈利通透晚期胚胎老化对25°C的效果可以看出，在图2。
- Dechorionation。轻轻冲洗胚胎关闭葡萄板到使用25°C的自来水和画笔网状筐。冲洗多余的酵母远离下自来水吹干篮下的胚胎。沉浸在篮下50％的漂白粉2分钟。彻底下的自来水流洗胚胎。注意：轻轻喷上间歇性使用塑料吸管的胚胎漂白剂溶液。而2分钟通常是足够的完整dechorionation，这个孵化时间应该由直接检查进行检查并进行相应调整。保持dechorionated胚胎浸泡在自来水中的篮子，并立即着手对EPS的一步。
- 每股盈利治疗
- 制备6 60mm的培养皿，在每个大约10毫升的PBS。在2.925毫升MBI溶解75微升准备的EPS摊薄每股收益M（1时40分）在与回旋50ml的玻璃烧杯中。注：从该混合物得到的白色乳液形式。
- 从网格篮实验室擦拭底部吸干多余的水分。篮子沉浸在烧杯中稀释每股收益和漩涡立刻驱散胚胎在篮子底部的EPS解决方案。继续旋转运动，持续30秒。注：EPS稀释和曝光时间可以变化，以控制渗透性。建议最佳稀释每股收益和治疗时间凭经验苍蝇所使用的菌株成立。增加曝光时间60-90秒，有利于舞台12岁及以上的胚胎。
- 删除篮子，吸干多余的走带EPS实验室擦拭。继续进行，在60mm的培养皿10mL的PBS 6的顺序洗涤。用塑料吸管轻轻喷胚胎用PBS各六个清洗的。继续染料和药物治疗的步骤。注意： 每股收益可出售倒入水槽。
3，染料和药物透性胚胎的治疗
- 染料处理
- 加入5微升10毫CY5羧酸染料*的MBIM-T（50μM的最终浓度）至1ml在1.5ml微量离心管中，并涡旋混合。注：*染料的选择取决于下游分析。 CY5羧酸是有效利用固定和染色后续分析。罗丹明B是活胚胎的分析非常有用。罗丹明B的红色发射，其代谢产物1的绿色发光，可以提出一些并发症与使用荧光下游应用。药物或毒素可以加入到染料溶液中开始治疗在此阶段，或以限制药物/毒素治疗的脉冲在这个阶段。应小心处理和处置的药物和毒素根据MSDS和环境安全标准。
- 从网篮转移胚胎到使用画笔的染料溶液。盖上管并倒转重复，以确保胚胎自由浮动在悬浮液中的染料溶液。放置管上的章动摇杆15分钟，在室温下进行。
- 从章动器取出试管，让胚胎定居。除去染料溶液，用细吸管和替换用1ml MBIM-T洗。反转管完全重新挂起胚胎。让胚胎定居并重复三个MBIM-T洗。从最后冲洗除去所有MBIM-T和继续孵育步骤。
- 培养胚胎发育
- 移植胚胎的两院之一：开发篮子或滑动室。注：开发篮优选更长的发育阶段，并且是必需的，如果后续的固定和染色步骤将被执行。滑动室是最佳的分辨率更高的时间推移成像，并且是最有效的短发育阶段（ 例如 ，早期胚胎的事件）。药物或毒素，可向培养基中加入各种浓度和胚胎ð才有发展可以实时用活的胚胎或端点处使用标准的固定和免疫染色的协议来监测。
- 发展篮
- 用70％乙醇喷出清洁发展篮子，用去离子水彻底冲洗并抹干与实验室擦拭。准备6毫升孵化介质与药物或毒素的所需的浓度。将发展篮子中型60毫米盘回吐照顾下的网格基础不是陷阱气泡。注意：两个介质常用的有：MBIM单独或MBIM/M3在50:50混合物，后者是更有效的较长的开发周期。
- 透转移胚胎到网面筐的底座采用了画笔。轻轻地从周围的水库唧与媒体的胚胎。分散的画笔将胚以使它们在网格上的一个单层。注意： 继续显微成像和评估公关的通透性和生存能力特点eparation（见第4步）。
- 发展中的滑动室
- 逆转滑动室和施加一个小珠的真空润滑脂在开口的周边。把150微升培养基中的药物或毒素在开口内溶解氧膜的表面的期望的量。注意：两个介质常用的有：MBIM单独或MBIM/M3在50:50混合物，后者是更有效的较长的开发周期。
- 透转移胚胎到媒体下降的画笔。分散使他们定居在下降中膜的胚胎。
- 小心运用25毫米的圆形盖玻片了开幕从而扁平化的媒介。轻轻按下沿盖玻片的周边，形成与油脂密封。注意： 继续显微成像来评价制剂的透化和活力的特性（见步骤4）。
4，鉴定出的透性活胚胎fication
- 确定透胚胎。根据落射荧光观察胚胎以配备有数码相机的显微镜。采集图像（在蓝色波长来确定配置文件蛋黄自发荧光）的使用固定显微镜和相机设置多个领域。
- 确定基于相对荧光强度胚胎通透。使用立体显微镜具有大的工作距离，以容纳篮并允许胚胎的操作。显微镜应该装有一个可编程XYZ载物台，落射荧光照明和数码相机。图像照顾到记录曝光和每个胚图像的阶段位置参数，以使相同的胚胎的重新评价在稍后的时间点的胚（见代表性的结果在图3中）。注意： 染料吸收的模式将取决于所用的染料，曝光和胚龄的长度变化。广泛跨越单一制剂染料吸收是典型的，并反映在透化的程度的变化。
- 确定可行的胚胎。标志着透胚胎的位置后，继续与胚胎发育在室温或25°C。返回篮子或滑动室的显微镜。观察下蓝色通道的荧光，并获得在先前确定的透胚胎蛋黄自发荧光的形象。根据卵黄分布的正常进展评估活力（见兰特等人 1和具有代表性的结果在图3中）。注意： 用明视野显微术观察到的胚胎的其他形态的特征可以被用于评估生存能力。建议建立渗透性，这与生存能力兼容的电平根据经验与每个染料和用于油炸食品的应变确定。
- 评估透活胚胎药物或毒素的效果。
- 胚胎多项式ssed与上述协议都准备了多种常规分析，药物或毒素暴露以后。几种不同类型的分析被认为是在下面的讨论，其中包括在活胚胎直接观察形态，以及后固定染色分析。这两种方法都是通过使用活体染料（ 例如 ，GFP），揭示基因表达模式和细胞谱系和形态学访问增强。
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Representative Results
胚胎处理装置， 如图1所示 ，以协助可视化在上述议定书“自制”的操作装置。结果如图2所示说明了他们的能力是由EPS为发展后期阶段的饲养透胚胎在18℃下的强大作用。此条件是在协议步骤2.1应用。该CY5羧酸染料以显示不同层次的渗透性通常出现在EPS处理的胚胎的功效被认为是在图3中 。在蛋黄的色素分布的发展的动力学也可见于图3中 ，揭示了用于评估生存能力的标准，如在协议中所述步骤4.2。该CY5染料在确定毒素治疗，甲醛固定和染色随后胚胎通透的效用由结果在图4中示出。
图1：胚胎处理设备的EPS方法的平底筐用于dechorination和EPS曝光步骤（A，A'）。发展筐用于透化胚胎（B，B'）更长的发展风险。滑动室是用于较短的发展风险和活胚胎更高分辨率成像（C，C'，见文本作进一步的说明）。
图2的影响在18℃下对EPS的疗效晚期胚胎老化。胚胎收集了两个小时后，在18℃下老化20小时（ 面板AA“
图3。注册CY5的渗透和可行的胚胎，胚胎收集了在25℃下2小时，熟化14小时，在18℃（相当于7-9小时的胚胎在25°C，12期）。 dechorination后，EPS治疗（在MBIM 1时40分，持续1分钟），进行随后培养在CY5染料（50μM中MBIM-T，15分钟）。胚胎被洗涤三次，在MBIM-T和在贮存器传送到显影篮子MBIM。发展被允许为proceed为8小时，在室温下进行。 CY5（红色）的摄取染料后处理和洗涤（A组 ），立即后8小时开发（B组 ）成像在远红外通道。蛋黄的分布是由自发荧光的蓝色通道看到。上染率，因此透气性，被认为是改变从胚胎到胎儿。 CY5染料（红色）被看作是定位于蛋黄（蓝色），成为浓缩，肠道中的阶段16（紫色，图B）的内腔中。
图4。测定在固定和免疫染色胚胎通透性和甲基汞的影响 。胚胎收集在25℃2小时，熟化14小时，在18℃（相当于7-9小时的胚胎在25°C，12期）。 dechorination后，EPS治疗（在MBIM 1时40分，持续1分钟），进行随后培养在CY5染料（50微米的MBIM-T，15分钟）与甲基汞在一起（50微米甲基汞，B组 ）或DMSO溶剂对照（0.1％终浓度， 图A）。胚胎液用MBIM-T和放置在显影篮子MBIM：在储M3介质和老化的另外8小时，在室温下进行。胚胎，然后固定在一个两相的4％多聚甲醛-庚烷的制备通过标准的协议14。具有抗Fasciclin II（绿色A，B和白色的A'，B'）进行染色标记的运动神经元和抗ELAV抗体（红色A，B）来标记所有神经元的细胞体。 CY5染料被直接荧光，这需要长时间的曝光，由于减少的荧光强度，由于固定（CY5是伪色中的所有面板蓝色）透露。甲基汞的影响是出现在不规则的图案和cluste环外侧chordotonal神经元细胞体（ELAV阳性，标记为红色，并标注有白色的箭头B对A）的。此外，该段（SN）（纯绿色箭头A'）的特性分支都被看作是与甲基汞对胚胎15之前报道影响是一致的甲基汞暴露（纯绿色箭头B“），充满变数。节间和节段的神经在它们的根的投影被视为能与甲基汞暴露（在B开绿色箭头'）向后移位。注：甲基汞是一种神经毒素。应小心处理时要戴手套和防护眼镜。处置应通过制度环境安全的设施和服务来完成。
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Discussion
上述方法概括的手段来获得可行的果蝇胚胎都可以访问的跨越广阔的发展范围小分子治疗。这个方法引入了新颖而简单的结论，即在18℃下老化使胚胎后期胚胎的通透性具有相同功效的以前只在早期胚胎中看到。此外，用远红染料CY5羧酸作为渗透性指标的已被证明有效的定位后的应用程序，并且不具有可用于揭示发育表型的常规的红色和绿色的荧光标记物产生干扰。这些发现显著推进的EPS方法的有效性和实用性。
这种方法适合于生物和固定胚胎制剂的分析。明使用显微镜和滑动室设置，典型特征得分第一胚胎发育的一半是形态发生这样的变动细胞化胚盘，头沟的形成，germband伸长率和germband回缩1。与GFP或RFP的记者更具体的端点就可以看出端倪， 比如早期的分割模式，形成神经结构在以后的发展1。 GFP和RFP报道也使观察生活中透胚胎在两个滑动室和发育篮制剂发展的事件。一个简单的方法来判断一个应用药物或化学品的总毒性监测卵黄蛋白自体荧光的蓝色通道的模式，以决定发展1的延迟或停止。
EPS的方法也有扩大对非模式昆虫，特别是蚊子，这股蛋壳相似的体系结构的调查工具的巨大潜力。小分子的其它昆虫物种的胚胎中的应用将开辟investigati的途径在何处标准遗传途径的功能研究是目前所缺乏的。在筐开发的胚胎可以为甲醛固定处理，因此，开放的分析以供研究果蝇免疫试剂广泛。但是，此步骤需要透化后的修正判定是表型与已经取得了访问的药物胚胎关联可行的。的CY5羧酸染料的应用已经证明这种方法非常有效。 CY5羧酸被有效地吸收在透化胚胎（ 图3A）。在开发过程中CY5集中在蛋黄，这是在最终阶段14隔离在形成肠的内腔和之后（ 图3B）。固定后，CY5荧光显着下降，但可靠地检测在肠道中，并作为那些被有效地在一开始就透胚胎的标志（见代表性水库ULT 图4）。但应注意的是，CY5检测在这个阶段，需要较长的相机曝光（ 例如 1-4秒）进行检测。因此，表型与免疫染色模式评分可以继续使用CY5信号与组织特异性标记（ 例如 ， 图4中可见神经特异性抗体）确认类似透胚胎在一起。
这种方法的最大挑战是胚胎存活到通透的过程中，一些长期困扰之前尝试开发这种方法9,10,16的敏感性。以通透随后的生存能力是赤裸裸的年龄依赖性，并急剧增加越老的胚胎是在通透9。然而，正如我们先前的研究显示，磁导率为1年龄越来越困难。最近的一份报告表明现在通过重新调用熟知通透晚期胚胎（14期）的能力烷按与d-苎烯17结合的溶剂。这后一种方法的广泛的实用性并不清楚，因为只有一个药物效果进行了表征（诺考达唑）和应用程序，以较早阶段的胚胎中未描述的17。此外，应用上述产量后期渗透性列出的18°C的开发步骤，并进一步避免使用有毒的有机溶剂。谁是新来的EPS协议研究者将在初始尝试通透性和可行性成果体验的变化。这里列出的步骤给研究者的工具来系统地而异的透化处理和随后的孵化步骤，条件，优化条件， 果蝇 ，他们正在自己的实验室环境下的特定菌株。
该方法的另一项挑战是在化学吸收可见从胚胎到胎儿的变化。这种变化体现在异质性染治疗（ 图3A）后，立即CY5染料吸收见于胚胎。与此相反，若丹明B染料比染料CY5（ 图2B“），更迅速，更均匀地分布在胚胎组织分散。因此，一些胚胎对胚胎的变异可以被包藏在化学，药物或感兴趣的毒素的分布性质，并且是固有的方法。其中剂量的定量是重要的，所以建议感兴趣的药物或毒素的摄取是通过另一种分析方法，其特征。尽管如此，便于上述协议的，并筛选数百胚胎的能力，允许研究者评估剂量反应和得分与资源投资少的表型特性，使得对于一个功能强大的第一种方法来表征药物或毒素在这个高度发达模型系统。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
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