Análisis de alto rendimiento de los mamíferos receptores olfativos: Medición de la activación del receptor a través de actividad luciferasa
Summary
Los patrones de activación de receptores olfativos codifican identidad olor, pero la falta de datos publicados identificar ligandos de olor para los receptores olfativos de mamíferos dificulta el desarrollo de un modelo integral de olor de codificación. Este protocolo describe un método para facilitar la identificación de alto rendimiento de ligandos de receptores olfativos y cuantificación de la activación del receptor.
Abstract
Odorantes crear patrones únicos y solapados de la activación del receptor olfativo, lo que permite una familia de aproximadamente 1.000 murino y 400 receptores humanos de reconocer miles de sustancias odoríferas. Ligandos odorizantes se han publicado para menos de 6% de los receptores humanos 1-11. Esta falta de datos se debe en parte a las dificultades que expresan funcionalmente estos receptores en sistemas heterólogos. Aquí, se describe un método para la expresión de la mayoría de la familia del receptor olfativo en las células Hana3A, seguido de evaluación de alto rendimiento de la activación del receptor olfativo usando un ensayo de indicador de luciferasa. Este ensayo se puede utilizar para (1) paneles de la pantalla de odorantes contra paneles de receptores olfativos; (2) confirmar la interacción odorante / receptor a través de las curvas de dosis-respuesta; y (3) comparar los niveles de activación del receptor entre variantes del receptor. En nuestros datos de la muestra, 328 receptores olfativos se proyectaron contra 26 odorantes. Pares Odorante / receptor con puntuaciones de las respuestas fueron variadas selecciónTed y probado en respuesta a la dosis. Estos datos indican que una pantalla es un método eficaz para enriquecer para los pares de odorante / receptor que pasarán un experimento de respuesta a la dosis, es decir, los receptores que tienen una respuesta de buena fe a un odorante. Por lo tanto, este ensayo de luciferasa de alto rendimiento es un método eficaz para caracterizar los receptores olfativos-un paso esencial hacia un modelo de olor de codificación en el sistema olfativo de los mamíferos.
Introduction
El sistema olfativo de los mamíferos tiene la capacidad de responder a un gran número de estímulos olorosos, lo que permite la detección y la discriminación de miles de sustancias odoríferas. Los receptores olfativos (OR) son los sensores moleculares expresadas por las neuronas sensoriales olfativas en el epitelio olfatorio 12. Mamíferos reconocimiento de olores se produce a través de la activación diferencial de las RUP por olores, y la familia de genes OR es extensa, con aproximadamente 1.000 murino y 400 receptores humanos 12-16. Análisis funcionales anteriores de RUP en las neuronas olfativas y en células heterólogas han demostrado que distintas sustancias odoríferas son reconocidos por único, pero los conjuntos de las RUP 10,17-20 superpuestas. Coincidencia de ligandos para las RUP es fundamental para entender el código olfativo y esencial para la construcción de modelos viables de la olfacción. Debido a las dificultades que expresan RUP en sistemas heterólogos, así como el gran número de ambos odorantes y OR, estos datos ha sido en gran parte ausente de la field; de hecho, menos del 6% de los humanos RUP tienen un ligando publicada 1-11. Este protocolo describe el uso de un ensayo de luciferasa para caracterizar odorantes / o interacciones. Este ensayo permite la caracterización de alto rendimiento de las RUP, una tarea que es esencial para entender odorante / o interacciones, así como el desarrollo de un modelo de codificación de olores.
Estudios de alto rendimiento de las RUP se enfrentan a tres grandes retos. En primer lugar, RUP expresados en células heterólogas se mantuvieron en la sala de emergencia y posteriormente degradados en el proteasoma 21,22, la prevención de las RUP de la interacción con los odorantes en el sistema de ensayo de 23-25. Este problema fue abordado por el descubrimiento de proteínas accesorias que facilitan la expresión estable de la superficie celular de una amplia gama de RUP 19,26,27. Receptor-transportador de proteínas 1 y 2 (RTP 1 y 2) promover o expresión de la superficie celular y la activación en respuesta a la estimulación olor 19. Basándose en este trabajo, las células HEK293T fueronmodificado para expresar de forma estable a largo RTP 1 (RTP1L) y RTP 2, la expresión de proteína para mejorar el receptor de 1, y G αolf, lo que resulta en la línea celular Hana3A 19,27. Además, el tipo 3 del receptor de acetilcolina muscarínico (M3-R) interactúa con RUP en la superficie celular y aumenta la activación en respuesta a odorantes 26. La co-transfección de un OR con RTP1S y M3-R en Hana3A células da como resultado la expresión robusta, coherente, y funcional de una amplia gama de SRO en la superficie de la célula 27. En segundo lugar, los mamíferos O repertorios son bastante grandes. En los seres humanos, por ejemplo, el repertorio O es un orden de magnitud más numerosos que el repertorio de receptores gustativos, y 2 órdenes de magnitud más numerosos que el repertorio de receptores visual. Aunque la clonación de una sola O es un protocolo relativamente sencillo, se requiere un esfuerzo significativo por adelantado para generar una completa biblioteca. En tercer lugar, aunque sabemos que en la visión, la longitud de onda se traduce en color yen la frecuencia de la audición se traduce en el tono, la organización de los olores es poco conocida, por lo que es difícil para los investigadores interpolan a partir de una muestra representativa de los odorantes. Aunque se han hecho algunos progresos en este frente 10,28, el mapa del paisaje olfativo sigue siendo incompleta. La evaluación de decenas de miles de moléculas en contra de cientos de las RUP es una tarea de enormes proporciones; pantallas de alto rendimiento en este ámbito requieren campañas cuidadosamente definidas. Los principales retos que quedan son las de logística y costo en lugar de los problemas inherentes a la técnica. Aunque selección heteróloga no ha sido ampliamente utilizada para identificar ligandos por grupos académicos, una empresa privada ha usado la misma técnica para identificar ligandos para 100 humanos RUP 29. Desafortunadamente, estos datos siguen siendo propietaria.
El ensayo de luciferasa de alto rendimiento descrito aquí tiene varias ventajas sobre los métodos alternativos utilizados para evaluar o activación. Aunque la responses de las neuronas sensoriales olfativas nativas se han medido utilizando electrofisiología y de imágenes de calcio, estas técnicas tienen dificultades bromas aparte que O conduce a la respuesta de una neurona debido a la superposición de propiedades de respuesta de las neuronas olfativas. Aunque golpear-en un tipo de receptor de GFP marcada con 30,31, la entrega de receptores específicos a través de adenovirus a murino neuronas olfativas 32,33, o la realización de la RT-PCR después de grabaciones 17,24,33 puede ligarse grabaciones a tipos de receptores individuales, estos métodos son bajo rendimiento y no es adecuado para pantallas de gran escala. Sistemas de detección heterólogos son más escalables, y dos formas principales se encuentran en la literatura: los reporteros de la vía cAMP y el inositol trifosfato (IP3) de los reporteros de la vía. Al olor estimulación, RUP activan una cascada de señalización T transducción αolf que resulta en la producción de AMP cíclico (AMPc) 12. Por co-transfección de un gen reportero de luciferasa de luciérnaga bajo el control de ACElemento de respuesta a AMP (CRE), la producción de luciferasa se puede medir como una función de la respuesta de olor, lo que permite la cuantificación de o activación. O de activación también puede vincularse a la vía IP3 por la co-expresión de las proteínas G como G α15/16 o un G-α15 olf quimera 24,25,34. Hemos elegido el ensayo que aquí se presenta sobre la base de tres factores: (1) la co-expresión de RTP1 con receptores olfativos etiquetados-Rho mejora la expresión de los receptores olfativos en la superficie celular 19,27; (2) uso de un gen reportero-AMPc de respuesta permite la medición de la o activación a través de la ruta del segundo mensajero canónica; y (3) el ensayo se adapta bien a las pantallas de alto rendimiento.
Este ensayo de luciferasa de alto rendimiento es aplicable a una variedad de estudios valiosos en el campo del olfato. En primer lugar, un gran número de RUP puede cribarse contra un único odorante con el fin de determinar el patrón de activación del receptor para un SPodorante ecific. Este tipo de estudio identificó OR7D4 como el OR responsable de responder a la androstenona odorante esteroide 8. Por el contrario, uno o se pueden cribar contra un panel de olores con el fin de determinar el perfil de la respuesta del receptor 10. Cuando el candidato olfativa odorante / o pares se identifican a través de estas pantallas, la interacción se puede confirmar mediante la realización de un experimento de respuesta a la dosis de examinar la respuesta de la O a concentraciones crecientes de odorante. Curvas de respuesta a la dosis también pueden evaluar cómo la variación genética en una OR afecta en respuesta odorante vitro 8,9,11,35, y estos estudios pueden ampliarse a interespecíficos o variación, lo que permite el examen de la evolución del receptor a través de especies y mutaciones causales en la evolución 36,37, Por último, este ensayo puede ser utilizado para seleccionar antagonistas de olor que son capaces de antagonizar o respuesta a un odorante particular para un par odorante / receptor conocido 38,39. En resumen, este altoEnsayo de luciferasa rendimiento es aplicable a una gama de estudios que ayudarán a caracterizar o patrones de activación y proporcionar una mejor comprensión de olor de codificación en el sistema olfativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identidad odorante es codificada por los patrones de activación de receptores olfativos, pero los patrones de activación del receptor, incluyendo el que los receptores se activan y en qué grado, son conocidos por menos del 6% de los receptores olfativos humanos 1-11. Los esfuerzos para caracterizar receptores olfativos han sido limitados por sus métodos o aplicabilidad de mano de obra intensiva para sólo un subconjunto de la familia de receptores olfativos 17,23,24,33,34. El sistema de expresi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta labor fue apoyada por R01 DC013339, R03 DC011373, y Ruth L. Kirschstein Servicio Nacional de Investigación Premio T32 DC000014. Una parte del trabajo se ha realizado mediante el Monell quimiosensorial Receptor Signaling Core, que es apoyada, en parte, con fondos del NIH P30 DC011735-NIDCD Core Grant. Los autores agradecen a C. Sezille para ayudar con la recolección de datos.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
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