تحليل الإنتاجية العالية من الثدييات شمي المستقبلات: قياس مستقبلات التنشيط عبر luciferase المراسل آخر
Summary
حاسة الشم أنماط تنشيط مستقبلات ترميز الهوية رائحة، ولكن عدم وجود بيانات نشرت تحديد بروابط الرائحة لمستقبلات الشمية الثدييات يعيق تطوير نموذج شامل للرائحة الترميز. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتسهيل التعرف الإنتاجية العالية من مستقبلات الشمية بروابط النوعي والكمي لتنشيط مستقبلات.
Abstract
عطر خلق أنماط فريدة من نوعها وتداخل تنشيط مستقبلات حاسة الشم، والسماح لأسرة مكونة من حوالي 1،000 الفئران و 400 مستقبلات الإنسان للاعتراف الآلاف من عطر. وقد نشرت بروابط الرائحة لأقل من 6٪ من مستقبلات الإنسان 1-11. ويرجع ذلك جزئيا إلى الصعوبات معربا عن ظيفيا هذه المستقبلات في أنظمة مغايرة هذا النقص في البيانات. هنا، نحن تصف طريقة للتعبير عن الأغلبية من عائلة مستقبلات الشمية في الخلايا Hana3A، تليها تقييم الإنتاجية العالية من تفعيل مستقبلات حاسة الشم باستخدام مقايسة luciferase المراسل الصحفي. هذا الاختبار يمكن استخدامها ل(1) لوحات شاشة عطر ضد مستقبلات الشمية لوحات؛ (2) تأكيد التفاعل الرائحة / مستقبلات عبر منحنيات الاستجابة للجرعة؛ و (3) مقارنة مستويات تنشيط مستقبلات بين المتغيرات مستقبلات. في نموذج البيانات لدينا، تم فحص 328 المستقبلات الشمية مقابل 26 عطر. كانت الرائحة أزواج / مستقبلات مع اختلاف درجات استجابة سلكتيد واختبارها في الاستجابة للجرعة. وتشير هذه البيانات إلى أن الشاشة هي وسيلة فعالة لإثراء للأزواج الرائحة / مستقبلات التي سيمر تجربة الاستجابة للجرعة، أي المستقبلات التي لديها استجابة حسنة النية إلى الرائحة. وبالتالي، فإن هذا الإنتاجية العالية luciferase الفحص هو وسيلة فعالة لتوصيف مستقبلات حاسة الشم وخطوة أساسية نحو نموذج من الترميز رائحة في نظام حاسة الشم لدى الثدييات.
Introduction
نظام حاسة الشم لدى الثدييات لديه القدرة على الرد على عدد كبير من المحفزات معطر، مما يسمح للكشف والتمييز الآلاف من عطر. المستقبلات الشمية (نسب الأرجحية) هي أجهزة الاستشعار الجزيئية التي أعرب عنها الخلايا العصبية الحسية الشمية في الظهارة الشمية 12. يحدث الاعتراف رائحة الثدييات من خلال تفعيل الفرق من نسب الأرجحية التي كتبها عطر، والأسرة الجين أو واسعة النطاق، مع ما يقرب من 1،000 الفئران و 400 مستقبلات الإنسان 12-16. وقد أظهرت التحليلات الفنية السابقة من نسب الأرجحية في الخلايا العصبية الشمية في الخلايا والتي مغاير عطر مختلفة معترف بها من قبل فريدة من نوعها، ولكن تداخل الفرق من نسب الأرجحية 10،17-20. مطابقة لنسب الأرجحية بروابط أمر بالغ الأهمية لفهم رمز الشم وضرورية لبناء نماذج قابلة للتطبيق من الشم. بسبب صعوبات التعبير عن نسب الأرجحية في أنظمة مغايرة فضلا عن عدد كبير من كل من عطر ونسب الأرجحية، كانت غائبة إلى حد كبير هذه البيانات من ودرع؛ في الواقع، فإن أقل من 6٪ من نسب الأرجحية البشرية لديها يجند نشرت 1-11. يصف هذا البروتوكول استخدام مقايسة luciferase المراسل لوصف الرائحة / أو التفاعلات. هذا الاختبار يمكن توصيف الإنتاجية العالية من أملاح الإماهة الفموية، وهي مهمة ضرورية لفهم الرائحة / أو التفاعلات وكذلك تطوير نموذج للرائحة الترميز.
تواجه الدراسات الإنتاجية العالية من نسب الأرجحية ثلاثة تحديات رئيسية. أولا، تم الإبقاء على نسب الأرجحية التي أعرب عنها في الخلايا مغاير في ER وتدهورت في وقت لاحق في proteasome و21،22، ومنع نسب الأرجحية من التفاعل مع عطر في نظام مقايسة 23-25. وقد وجهت هذه المشكلة عن طريق اكتشاف البروتينات التي تسهل التبعي مستقرة التعبير سطح الخلية من مجموعة واسعة من نسب الأرجحية 19،26،27. مستقبلات نقل البروتينات 1 و 2 (RTP1 و2) تعزيز أو التعبير سطح الخلية وتفعيل ردا على التحفيز الرائحة 19. على أساس هذا العمل، وكانت الخلايا HEK293Tتعديل للتعبير ثابت RTP1 طويلة (RTP1L) وRTP2، مستقبلات البروتين تعزيز التعبير 1، وG αolf، مما أدى إلى خط الخلية Hana3A 19،27. بالإضافة إلى ذلك، نوع 3 المسكارينية مستقبلات الأستيل كولين (M3-R) يتفاعل مع نسب الأرجحية على سطح الخلية ويعزز التنشيط استجابة لعطر 26. شارك في ترنسفكأيشن لأو مع RTP1S وM3-R في Hana3A خلايا النتائج في التعبير قوية ومتسقة وظيفية من مجموعة واسعة من نسب الأرجحية على سطح الخلية 27. الثانية، الثدييات أو ذخيرة كبيرة جدا. في البشر، على سبيل المثال، مرجع أو هو أمر من حجم أكثر عددا من مستقبلات ذخيرة الذوقية، و 2 أوامر من حجم أكثر عددا من مستقبلات بصرية ذخيرة. على الرغم من أن استنساخ واحد أو هو بروتوكول بسيط نسبيا، مطلوب جهد مقدما كبيرة لإنشاء مكتبة شاملة. الثالث، على الرغم من أننا نعرف أن في الرؤية، والطول الموجي يترجم إلى لون وفي وتيرة الاختبار يترجم إلى الملعب، ومن المفهوم تنظيم الروائح سيئة، مما يجعل من الصعب على الباحثين أن أقحم من عينة تمثيلية من عطر. على الرغم من إحراز بعض التقدم على هذه الجبهة 10،28، وخريطة المشهد حاسة الشم لا تزال غير مكتملة. فحص عشرات الآلاف من الجزيئات ضد المئات من نسب الأرجحية هي مهمة شاقة؛ تتطلب شاشات عالية الإنتاجية في هذا المجال حملات محددة بعناية. التحديات الرئيسية المتبقية هي تلك الخدمات اللوجستية والتكلفة بدلا من المشاكل الملازمة لهذه التقنية. على الرغم من أن الفحص مغاير لم يستخدم على نطاق واسع لتحديد بروابط من قبل الجماعات الأكاديمية، وقد استخدمت شركة خاصة نفس الأسلوب لتحديد بروابط نسب الأرجحية ل100 الإنسان 29. للأسف، لا تزال هذه البيانات الشخصية.
مقايسة luciferase المراسل الإنتاجية العالية المذكورة هنا لديها العديد من المزايا أكثر من الطرق البديلة المستخدمة لتقييم أو التنشيط. على الرغم من أن المسؤولةوقد تم قياس سيس من الخلايا العصبية الحسية الشمية الأم باستخدام الكهربية والتصوير الكالسيوم، وهذه التقنيات يجدون صعوبة في إغاظة وبصرف النظر الذي يؤدي إلى استجابة أو الخلايا العصبية بسبب عدم التداخل في خصائص استجابة الخلايا العصبية لحاسة الشم. على الرغم من أن يطرق-في GFP المسمى نوع مستقبلات 30،31، وتقديم مستقبلات معينة عبر اتش لالفئران الخلايا العصبية الشمية 32،33، أو أداء RT-PCR بعد التسجيلات 17،24،33 يمكن ربط تسجيلات لأنواع مستقبلات واحدة، وهذه الأساليب هي منخفضة الإنتاجية وغير مناسبة للشاشات واسعة النطاق. أنظمة الفحص مغايرة هي أكثر استيعابا، وتوجد شكلين رئيسيين في الأدب: مسار للصحفيين المخيم واينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) للصحفيين المسار. على التحفيز رائحة، نسب الأرجحية تنشيط إشارة تتالي تنبيغ G αolf أن النتائج في إنتاج دوري امبير (المخيم) 12. من قبل المشترك transfecting على يراعة luciferase مراسل الجينات تحت سيطرة ميلانAMP عنصر الاستجابة (لجنة المساواة العرقية)، ويمكن قياس إنتاج luciferase المراسل بوصفها وظيفة من استجابة رائحة، مما يسمح لتقدير حجم أو التنشيط. أو التنشيط ويمكن أيضا أن تكون مرتبطة مسار IP3 قبل المشترك، معربا عن G-البروتينات مثل G α15/16 أو G-α15 جبهة تحرير أورومو الوهم 24،25،34. اخترناه مقايسة المقدمة هنا على أساس ثلاثة عوامل هي: (1) شارك في التعبير عن RTP1 مع المستقبلات الشمية رو الموسومة يحسن التعبير عن مستقبلات الشمية على سطح الخلية 19،27؛ (2) استخدام الجينات مراسل المخيم تستجيب يسمح لقياس أو التنشيط من خلال الكنسي الثاني مسار رسول؛ و (3) الفحص هو مناسبة تماما لشاشات عالية الإنتاجية.
هذا luciferase الفحص الإنتاجية العالية هي التي تنطبق على مجموعة متنوعة من دراسات قيمة في مجال الشم. أولا، عدد كبير من نسب الأرجحية يمكن فحص ضد الرائحة واحد من أجل تحديد نمط تنشيط مستقبلات ليرة سوريةالرائحة ecific. هذا النوع من الدراسة تحديد OR7D4 كما OR المسؤولة عن الاستجابة لandrostenone الرائحة الستيرويد 8. على العكس، واحدة أو يمكن فحص ضد فريق من عطر من أجل تحديد ملف استجابة مستقبلات 10. عندما يتم تحديد مرشح حاسة الشم الرائحة / أو أزواج عبر هذه الشاشات، ويمكن التأكد من التفاعل عن طريق إجراء تجربة الاستجابة للجرعة دراسة استجابة أو لتركيزات متزايدة من الرائحة. يمكن منحنيات الاستجابة للجرعة أيضا تقييم مدى الاختلاف الجيني في أو يؤثر في استجابة الرائحة المختبر 8،9،11،35، ويمكن تمديد هذه الدراسات إلى الاختلاف بين الأنواع أو، مما يسمح لفحص تطور مستقبلات عبر الأنواع والطفرات المسببة في تطور 36،37، وأخيرا، وهذا الفحص يمكن استخدامها للكشف عن مضادات الرائحة التي هي قادرة على استعداء أو ردا على الرائحة خاص لزوج الرائحة / مستقبلات المعروفة 38،39. باختصار، هذا عالية-الإنتاجية luciferase الفحص ينطبق على مجموعة من الدراسات التي تساعد تميز أو أنماط التنشيط وتوفير فهم أفضل للرائحة الترميز في نظام حاسة الشم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم ترميز هوية الرائحة بواسطة حاسة الشم أنماط تنشيط مستقبلات، ولكن من المعروف أنماط تنشيط مستقبلات، بما في ذلك المستقبلات التي يتم تنشيطها وإلى أي درجة، لأقل من 6٪ من المستقبلات الشمية الإنسان 1-11. تم بذل جهود لتوصيف المستقبلات الشمية محدودة بسبب الأساليب كثيف?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل R01 DC013339، R03 DC011373، وروث L. كيرشتاين خدمة القومي للبحوث جائزة T32 DC000014. تم تنفيذ جزء من العمل باستخدام مونيل حسي كيميائي مستقبلات الإشارات الأساسية، الذي تدعمه، في جزء منه، من خلال تمويل من P30 DC011735 NIH-NIDCD الأساسية غرانت. المؤلفين أشكر C. Sezille للمساعدة في جمع البيانات.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
Riferimenti
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, a. D., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
