Hög kapacitet Analys av däggdjur luktreceptorer: Mätning av receptoraktivering via luciferasaktivitet
Summary
Luktreceptoraktiveringsmönster koda lukt identitet, men bristen på publicerade data som identifierar doftligander för däggdjursluktreceptorer hindrar utvecklingen av en heltäckande modell av lukt kodning. Detta protokoll beskriver en metod för att underlätta hög genomströmning för identifiering av luktreceptorligander och kvantifiering av receptoraktivering.
Abstract
Odörer skapa unika och överlappande mönster av luktreceptoraktivering, vilket gör att en familj på ca 1.000 murina och 400 humana receptorer för att känna igen tusentals luktämnen. Doftligander har publicerats för färre än 6% av humana receptorer 1-11. Denna brist på information beror delvis på svårigheter funktionellt uttrycker dessa receptorer i heterologa system. Här beskriver vi en metod för att uttrycka de flesta av det olfaktoriska receptorfamiljen i Hana3A celler, följt av hög genomströmning bedömning av luktreceptoraktivering med användning av en luciferas-reporteranalys. Denna analys kan användas för att (1) skärmpaneler av odörer mot paneler av luktreceptorer; (2) bekräfta lukt / receptor interaktion via dos-responskurvor; och (3) jämföra receptoraktiveringsnivåer bland receptorvarianter. I vår exempeldata har 328 luktreceptorer screenas mot 26 doftämnen. Luktämne / receptorpar med varierande svars ställningar var urvalted och testas i dos respons. Dessa data indikerar att en skärm är en effektiv metod att anrika odorant / receptor par som kommer att passera en dos-responsexperiment, dvs receptorer som har en bona fide-svar på ett luktämne. Därför är denna hög genomströmning luciferasanalys en effektiv metod för att karaktärisera olfaktoriska receptorer-ett väsentligt steg i riktning mot en modell av lukt kodning i däggdjurens olfaktoriska systemet.
Introduction
Den däggdjur luktsinne har förmågan att svara på ett stort antal luktande stimuli, gör det möjligt att upptäcka och diskriminering av tusentals luktämnen. Luktreceptorer (OR) är de molekylära sensorer som uttrycks av lukt sensoriska nervceller i luktepitel 12. Däggdjurs lukt erkännande sker genom differentiell aktivering av yttersta randområdena av luktämnen, och OR genfamiljen är omfattande, med ungefär 1.000 murina och 400 humana receptorer 12-16. Tidigare funktionella analyser av de yttersta randområdena i doft nervceller och i heterologa celler har visat att olika doftämnen är erkända av unika, men överlappande ensembler av yttersta rand 10,17-20. Matchande ligander till de yttersta randområdena är avgörande för förståelsen av lukt kod och nödvändiga för att bygga hållbara modeller av luktsystemet. På grund av svårigheter som uttrycker yttersta randområdena i heterologa system samt det stora antal både luktämnen och de yttersta randområdena, har dessa data i stort sett varit frånvarande från field; Färre än 6% av den mänskliga yttersta randområdena har en publicerad ligand 1-11. Detta protokoll beskriver användningen av en luciferasanalys att karakterisera odorant / ELLER interaktioner. Denna analys möjliggör hög genomströmning karakterisering av yttersta randområdena, en uppgift som är nödvändig för att förstå luktämnen / ELLER interaktioner samt att utveckla en modell för lukt kodning.
Hög genomströmning studier av yttersta randområdena står inför tre stora utmaningar. Först var de yttersta randområdena som uttrycks i heterologa celler kvar i ER och degraderas därefter i proteasomen 21,22, hindrar de yttersta randområdena från att interagera med odörer i analyssystemet 23-25. Detta problem togs upp av upptäckten av tillbehör proteiner som underlättar stabila cellytan uttryck för ett brett spektrum av yttersta randområdena 19,26,27. Receptor-transportör-protein 1 och 2 (RTP1 och 2) främja ELLER cellyteexpression och aktivering som svar på luktämnen stimulering 19. Baserat på detta arbete, HEK293T cellermodifieras för att stabilt uttrycka RTP1 lång (RTP1L) och RTP2, receptorexpressionsförstärkande protein 1 och G αolf, vilket resulterar i Hana3A cellinjen 19,27. Dessutom typ 3 muskarinacetylkolinreceptorn (M3-R) samverkar med ORs vid cellytan och förbättrar aktivering som svar på doftämnen 26. Co-transfektion av en OR med RTP1S och M3-R in Hana3A celler resulterar i robusta, konsekvent och funktionellt uttryck av ett brett spektrum av ORs vid cellytan 27. För det andra, däggdjurs-eller repertoarer är ganska stora. Hos människor, till exempel, är det OR repertoar en storleksordning talrikare än den smakreceptorrepertoar, och 2 storleksordningar talrikare än den visuella receptorrepertoar. Trots att klona en enda OR är en relativt enkelt protokoll, är betydande initiala insatser som krävs för att skapa ett omfattande bibliotek. För det tredje, även om vi vet att i en syn, översätter våglängd i färg ochi audition frekvens leder till beck, är organisationen av lukter dåligt kända, vilket gör det svårt för forskare att interpolera från ett representativt urval av doftämnen. Även om vissa framsteg har gjorts på den fronten 10,28, kartan över lukt landskapet är fortfarande ofullständig. Screening tiotusentals molekyler mot hundratals yttersta randområdena är en svår uppgift; hög genomströmning skärmar på detta område kräver noga definierade kampanjer. De stora utmaningar som återstår är de av logistik och kostnader snarare än problem inneboende i tekniken. Även heterologa screening inte har i stor utsträckning använts för att identifiera ligander med akademiska grupper, har ett privat företag använt samma teknik för att identifiera ligander för 100 mänskliga yttersta randområdena 29. Tyvärr är dessa uppgifter förblir äganderätt.
Den hög genomströmning luciferasanalysen beskrivs här har flera fördelar jämfört med alternativa metoder för att bedöma eller aktivering. Fastän ansvarigtses av inhemska lukt sensoriska neuroner har mätts med hjälp av elektrofysiologi och kalcium avbildning, dessa tekniker har svårt att retas isär vilket ELLER leder till en neuron svar på grund av överlappningen i svarsegenskaper för lukt nervceller. Trots att knacka in en GFP-märkt receptor typ 30,31, leverera specifika receptorer via adenovirus att murina lukt nervceller 32,33, eller utförande av RT-PCR efter inspelningar 17,24,33 kan länka inspelningar till enstaka receptortyper, dessa metoder är låg genomströmning och inte lämpar sig för storskalig skärmar. Heterologa screening system är mer skalbara, och två stora former finns i litteraturen: cAMP vägen reportrar och inositol trifosfat (IP3) pathway reportrar. Vid luktstimulering, ORs aktivera ett G αolf transduktion signalkaskad som resulterar i produktionen av cykliskt AMP (cAMP) 12. Genom sam-transfektera en eldfluga luciferas-reportergenen under kontroll av acAMP-responselement (CRE), kan luciferas produktion mätas som en funktion av luktsvar, vilket möjliggör kvantifiering av ELLER-aktivering. Eller aktivering kan också vara kopplade till IP3 pathway genom samuttrycker G-proteiner såsom G α15/16 eller en G α15-olf chimären 24,25,34. Vi har valt den analys som presenteras här bygger på tre faktorer: (1) samuttrycket av RTP1 med Rho-taggade luktreceptorer ökar uttrycket av luktreceptorer på cellytan 19,27; (2) användning av ett cAMP-reportergen möjliggör mätning av eller aktivering genom den kanoniska andra budbärarreaktionsväg; och (3) analysen är väl lämpad för hög genomströmning skärmar.
Denna high-throughput luciferas-analysen kan tillämpas på en mängd olika studier värdefulla för området olfaction. För det första kan ett stort antal ORs screenas mot ett enda luktämne för att bestämma receptoraktiveringsmönster för en specific luktämne. Denna typ av studie identifierade OR7D4 som OR ansvarig för att svara på steroider luktämnen androstenon 8. Omvänt, en ELLER kan screenas mot en panel av luktämnen i syfte att bestämma profilen receptorsvar 10. När kandidaten lukt odorant / ELLER paren identifieras via dessa skärmar, kan interaktion bekräftas genom att utföra en dos-responsexperiment undersöka svaret från ELLER till ökande koncentrationer av luktämnen. Dos-responskurvor kan också bedöma hur genetisk variation i en OR påverkar in vitro luktämnen svar 8,9,11,35, och dessa studier kan utökas till mellanarts ELLER variation, gör det möjligt att undersöka receptor evolution mellan arter och kausala mutationer i evolutionen 36,37, slutligen denna analys kan användas för att screena för lukt antagonister, som är i stånd att antagonisera ELLER svar på en särskild luktämne för en känd odorant / receptorparet 38,39. I sammanfattning, denna högaGenomströmning luciferas-analysen är tillämplig på en rad studier som hjälper karakterisera ELLER aktiveringsmönster och ge en bättre förståelse av lukt kodning i luktsinnet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Luktämnen identitet kodas av luktreceptoraktiveringsmönster, men receptoraktiveringsmönster, bland vilka receptorer aktiveras och i vilken utsträckning, är kända för färre än 6% av den mänskliga luktreceptorer 1-11. Arbetet med att karakterisera luktreceptorer har begränsats av deras arbetsintensiva metoder eller tillämplighet på endast en delmängd av luktreceptorfamiljen 17,23,24,33,34. Den Hana3A heterologa expressionssystemet stöder robust uttryck av majoriteten av testade luktrec…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av R01 DC013339, R03 DC011373, och Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. En del av det arbete som utfördes med hjälp av Monell Chemosensory Receptor Signa Core, som stöds, delvis, genom finansiering från NIH-NIDCD Kärna Grant P30 DC011735. Författarna tackar C. Sezille för hjälp med datainsamling.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
Riferimenti
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, a. D., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
