Lusiferaz aktivitesi ile reseptör aktivasyonunun bir ölçümü: Memeli Koku reseptörünün yüksek throughput Analizi
Summary
Koku reseptör aktivasyonu desenler koku kimliğini kodlamak, ancak memeli koku reseptörleri için Odorant ligandlar belirlenmesi yayınlanan verilerin eksikliği koku kodlama kapsamlı bir modelinin gelişmesini engellemektedir. Bu protokol, koku reseptör ligandları ve reseptör aktivasyonunun miktar yüksek throughput belirlenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem tarif etmektedir.
Abstract
Parfüm yaklaşık 1000 murin ve 400 insan reseptörleri ailesidir koku binlerce tanımak için izin koku reseptör aktivasyonunun benzersiz ve üst üste gelen desenleri oluşturmak. Odorant ligandlar insan reseptörleri 1-11 az% 6 yayınlanmıştır. Bu veri eksikliği, kısmen fonksiyonel heterolog sistemlerde bu reseptörleri eksprese zorluklar kaynaklanmaktadır. Burada, bir lusiferaz haberci deneyi kullanılarak koku reseptör aktivasyonunun, yüksek verimli değerlendirme ardından Hana3A hücrelerde koku reseptör ailesinin, çoğunluğu ifade etmek için bir yöntem tarif eder. Bu deney, koku reseptörlerinin panel karşı koku maddesi (1) ekran panelleri için de kullanılabilir; (2) doz tepki eğrileri ile odorant / reseptör etkileşimi teyit; ve (3) reseptör varyantlar arasında reseptörü aktivasyon düzeyleri karşılaştırın. Bizim örnek veri, 328 koku reseptörleri 26 koku karşı tarandı. Değişen tepki puanları ile odorant / reseptör çifti selec edildited ve doz yanıt olarak test edilmiştir. Bu veriler, bir ekran, bir koku verici madde için iyi niyetli bir tepki, yani reseptörleri, bir doz cevap deneyi geçecek odorant / alıcı çiftleri için zenginleştirmek için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, bu yüksek verimli bir lusiferaz deney memeli koku koku kodlama sisteminde bir modeline doğru koku reseptörleri temel bir adım karakterize etmek için etkili bir yöntemdir.
Introduction
Memeli koku algılama sistemi, ve koku binlerce ayrım sağlayan, kokulu uyaranlara bir çok sayıda yanıt yeteneğine sahiptir. Koku reseptörleri (OR) koku epiteli 12 koku duyusal nöronlar tarafından ifade moleküler sensörler bulunmaktadır. Memeli koku tanıma koku tarafından ameliyathanelerinde diferansiyel aktivasyonu yoluyla gerçekleşir ve OR gen ailesi kabaca 1.000 kemirgen ve 400 insan reseptörleri 12-16 ile kapsamlıdır. Koku nöronlarda ve heterolog hücrelerde ameliyathanelerinde önceki fonksiyonel analizleri farklı katkılar benzersiz tarafından tanınan olduğunu göstermiştir, ancak OR 10,17-20 arasında toplulukları örtüşen var. Ameliyathanelerinde ligandları Eşleştirme koku kodunu ve koku duyusunun uygulanabilir modeller oluşturmak için gerekli anlamak için önemlidir. Nedeniyle koku ve ORs hem de çok sayıda hem de heterolog sistemlerde eksprese OR'lar zorluklar, bu veriler f büyük ölçüde yok olduield; Gerçekten, insan ameliyathanelerinde azının% 6, yayımlanmış bir ligandı 1-11 var. Bu protokol odorant / veya karakterize etmek için bir etkileşimi lusiferaz tahlilin kullanımını tarif eder. Bu tahlil ameliyathanelerinde yüksek verimlilik karakterizasyonu, Deodorantını / VEYA etkileşimleri anlamak yanı sıra koku kodlama bir model geliştirmek için gerekli bir görevi sağlar.
Ameliyathanelerinde yüksek verimlilik çalışmaları üç büyük sorunlarla karşı karşıyadır. İlk olarak, heterolog hücrelerde ifade edilen ORs ER 'in içinde muhafaza edildi ve daha sonra, deney sisteminde 23-25 koku maddeleri ile etkileşim ORS önlenmesi, proteazom 21,22 parçalanır. Bu sorun OR'lar 19,26,27 geniş bir yelpazede stabil hücre yüzey ifadesini kolaylaştıran aksesuar proteinlerin keşif tarafından ele alındı. Reseptör-taşıyıcı proteinler-1 ve 2 (RTP1 ve 2) desteklemek OR odorant uyarılması 19 tepki olarak hücre yüzey ifadesi ve aktivasyonu. Bu çalışmalara dayanarak, HEK293T hücreleriydikararlı bir şekilde hücre çizgisi 19,27 Hana3A sonuçlanan RTP1 uzun (RTP1L) ve RTP2, reseptör ekspresyon arttırıcı protein 1 ve G αolf ifade için değiştirilebilir. Buna ek olarak, tip 3 muskarinik asetilkolin reseptörü (M3-R), hücre yüzeyinde ORs ile etkileşime girer ve koku 26 yanıt olarak aktivasyonunu artırır. Hücre yüzeyi 27 de ORs geniş bir aralığının, sağlam, tutarlı ve fonksiyonel ifade Hana3A hücreler sonuçlara RTP1S ve M3-R ile bir OR ko-transfeksiyonu. İkinci olarak, memeli ya da repertuarları oldukça büyüktür. İnsanlarda, örneğin, VEYA repertuar tat reseptör repertuvarının daha çok büyüklükte bir sipariş olduğunu ve görsel reseptör repertuvarının daha çok büyüklük 2 emirleri. Tek bir klonlama ya da nispeten basit bir protokoldür, ancak önemli ön nitelikli kapsamlı bir kitaplık oluşturmak için gereklidir. Biz vizyonu olduğunu bilmenize rağmen Üçüncü olarak, dalga boyu renk çevirir veSeçmeler frekans sahası içine çevirir içinde, kokuların organizasyonu kötü zor araştırmacılar koku temsili bir örnek katmak için yapıyor, anlaşılmaktadır. Bazı ilerlemeler bu ön 10,28 üzerinde yapılmış olmasına rağmen, koku manzara haritası eksik kalır. Ameliyathanelerinde yüzlerce karşı onlarca moleküllerinin binlerce Tarama yıldırıcı bir iştir; Bu alanda yüksek verim ekranlar dikkatlice tanımlanmış kampanyalar gerektirebilir. Geri kalan en büyük zorluklar yerine tekniğe özgü problemlere göre lojistik ve maliyet olanlardır. Heterolog tarama yaygın akademik grupları ligandları tanımlamak için kullanılır olmasına rağmen, bir özel şirket 100 insan ameliyathanelerinde 29 ligandlar tanımlamak için aynı tekniği kullandı. Ne yazık ki, bu veriler, özel kalır.
Burada özetlenen yüksek verimli bir lusiferaz deney değerlendirmek veya aktivasyon için kullanılan diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Her ne kadar sorumluluğuyerli koku duyu nöronlarının ses elektrofizyoloji ve kalsiyum görüntüleme kullanılarak ölçülmüş, bu teknikler zorluğu nedeniyle koku nöronlar için tepki özellikleri örtüşme bir nöronun tepki yol açar VEYA ayrı alay var. , GFP etiketli reseptör tipi 30,31 in-vurma 32,33 koku nöronlar sıçangile adenovirüs üzerinden belirli reseptörleri teslim, ya da 17,24,33 tek reseptör türlerine kayıtları bağlayabilirsiniz kayıtlarından sonra RT-PCR performans, bu yöntemler olmasına rağmen düşük verimlilik ve büyük ölçekli ekranlar için uygun değildir. Heterolog tarama sistemleri daha ölçeklenebilir, ve iki büyük formları literatürde bulunur: cAMP yolunun muhabirleri ve inositol trifosfat (IP3) yolunun muhabirler. Koku uyarılması üzerine, ORs, siklik AMP (cAMP) 12 üretimi ile sonuçlanan bir sinyal transdüksiyon G αolf kaskadını aktive. Ac kontrolü altında ateş böceği lusiferaz raportör geni ile ko-transfekteAMP yanıt elemanı (CRE), lusiferaz üretimi miktarının ya da aktivasyon sağlayan, koku yanıtı bir fonksiyonu olarak ölçülebilir. Ya da aktivasyon, aynı zamanda, G ya da G α15/16 α15-olf kimera 24,25,34 olarak G-proteinleri ko-ifade ile IP3 yolu ile bağlantılı olabilir. Üç faktörlere dayalı Burada yer alan tahlili seçtik: Rho-etiketli koku reseptörleri ile RTP1 (1) eş-ekspresyon hücre yüzeyi 19,27 az koku reseptör ekspresyonunu iyileştirir; (2) bir cAMP tepki veren bildirici genin kullanımı ölçülmesi OR kanonik ikinci haberci yolu ile aktivasyonu için izin verir; ve (3) deney yüksek verimli taramalar için çok uygundur.
Bu, yüksek verimli lusiferaz deney olfaction alanında değerli çalışmalar çeşitli uygulanabilir. İlk olarak, ORs, çok sayıda, bir sp için reseptör aktivasyon modelini belirlemek amacıyla tek bir koku verici madde karşı taranabilirecific Odorant. Çalışmanın bu tür steroid odorant Androstenone 8 yanıt için OR sorumlu OR7D4 olarak tespit edilmiştir. Bunun tersine, bir ya da reseptör karşılığı profilini 10 belirlemek amacıyla koku bir paneline karşı taranabilir. Aday koku odorant / veya çiftleri bu ekranların ile tespit edilirse, koku verici madde etkileşim artan konsantrasyonları için ya da tepkisini inceleyen bir doz tepki deney ile teyit edilebilir. Doz yanıt eğrileri de ameliyathanede genetik varyasyon vitro Odorant yanıt 8,9,11,35 olarak nasıl etkilediğini değerlendirmek ve bu çalışmaların evrim türlerin ve nedensel mutasyonlar arasında reseptör evrim incelenmesi için izin interspesifik VEYA varyasyona uzatılabilir 36,37, Son olarak, bu deney, antagonize etmek mümkün ya da bilinen bir odorant / reseptör çifti 38,39 için belirli bir koku verici madde için olan koku yanıtı antagonistlerinin taranması için de kullanılabilir. Özet olarak, bu yüksekVerimlilik lusiferaz tahlil karakterize yardımcı VEYA aktivasyon desen ve koku sisteminde koku kodlama daha iyi anlaşılmasını sağlayacak çalışmalar bir dizi uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Koku maddesi kimlik olfaktori reseptör aktivasyon paternlerinin ile kodlanan, ancak reseptörleri aktive edilmiş ve hangi dereceye kadar olan da dahil olmak üzere alıcı aktivasyonu desenler insan olfaktori reseptör 1-11 arasında daha az% 6 ile tanınırlar. Koku reseptörleri karakterize etmek için çabalar koku reseptör ailesi 17,23,24,33,34 sadece bir alt kendi emek-yoğun yöntemlerle veya uygulanabilirliği ile sınırlı kalmıştır. Hana3A heterolog sentezleme sistemi, test edilen k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, R01 DC013339, R03 DC011373 ve Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü T32 DC000014 tarafından desteklenmiştir. Işin bir kısmı NIH-NIDCD Çekirdek Grant P30 DC011735 fon tarafından, kısmen desteklenen Monell kimyasal duyusal Reseptör Sinyalizasyon Çekirdek kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yazarlar veri toplama ile yardım için C. Sezille teşekkür ederim.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
Riferimenti
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, a. D., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
