ניסויי immunoprecipitation SILAC מייצגים אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים, ואינטראקציות זיקה נמוכות נשמרו באמצעות שימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים.
פרוטאומיקה כמותית בשילוב עם טיהור חיסונית זיקה, immunoprecipitation SILAC, מייצגת אמצעי רב עוצמה לגילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון. על ידי המאפשר כימות היחסית מדויקת של שפע חלבון בשליטה והן דגימות בדיקה, אינטראקציות אמיתי ניתן להבחין בקלות ממזהמים ניסיוניים. ניתן לשמר אינטראקציות זיקה נמוכה באמצעות השימוש בתנאי חיץ פחות מחמירים ויישארו לזיהוי בקלות. פרוטוקול זה דן בתיוג של תאים בתרבית רקמה עם חומצות אמינו שכותרתו איזוטופ היציב, transfection וimmunoprecipitation של זיקה מתויג חלבון של עניין, ואחריה ההכנה להגשה למתקן ספקטרומטריית מסה. פרוטוקול זה אז מסביר כיצד לנתח ולפרש את הנתונים שהוחזרו מספקטרומטר המסה על מנת לזהות שותפים סלולריים אינטראקציה עם חלבון של עניין. כדוגמא טכניקה זו תחול על iDENתצדיק את החלבונים מחייבים את גורמי חניכה תרגום אוקריוטים: eIF4AI וeIF4AII.
צעד חיוני בהבנת תפקוד חלבון הוא זיהוי של חלבוני אינטראקציה רלוונטיים. איפה חלבונים כאלה אינם ידועים יש מספר טכניקות זמינות, כל אחד עם יתרונות משלהם וחסרונות. אלה כוללים את מערכת השמרים שני ההיברידית, מבחני הנפתח באמצעות חלבון רקומביננטי, כמו גם טיהור זיקת טנדם או TAP תיוג 1, 2.
בנוסף אחרונים יותר לטכניקות אלה הוא שילוב של טיהור זיקה של חלבון של עניין משורת תאים של יונקים רלוונטיים, ואחריו על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית באמצעות תיוג איזוטופ יציב של חומצות אמינו בתרבית תאים 3 (SILAC). זו יש יתרונות על פני הגישה של שני ההיברידית שמרים שבלוקליזציה התא ולאחר translational שינויים אינם מוטרדים, כמו גם יתרונות על פני מסורתי בכך שהיא היא גישת כמותית ולא איכותית המאפשרת למשתמש ריאה תיוג TAP dily להבחין שאינו במיוחד באינטראקציה חלבונים וחומרים מזהמים, מגורמי מארח שלהיקשר באופן ספציפי. יתר על כן, כמדגם מנותח בדרך כלל כולו, ולא להקות חלבון בודדות, כמו, חלבונים של עניין אינם רעול פנים על ידי דומה נודדים חלבונים על ג'ל, ואין הם בדרך כלל צריכים להיות נוכחים ברמות מספיקות כדי להיות גלוי לאחר צביעה, מה שמוביל ל מספרים מוגברים של חלבונים שזוהו בביטחון 4.
כדי להדגים את הטכניקה הזו, התכה GFP של גורם החניכה תרגום אוקריוטים הקשור קשר הדוק eIF4AI וeIF4AII מניה שעל זהות חומצת אמין 90% נחקרו על ידי פרוטאומיקה כמותיים SILAC-immunoprecipitation. eIF4AI האדם והשני היו משובטים לתוך pEGFP-C1 ליצירת חלבון היתוך שבו GFP הוא קבע את N-הסופית של eIF4A. כדי למנוע את הצורך ביצירת שורות תאי יציבות transfection חולף שימש כדי לספק המבנים הללו לתאי איזוטופ יציבים שכותרת 293T.
<p class="Jove_content"> תאים תויגו ראשון במשך שבועיים בתקשורת תרבות תא SILAC, ואחרי transfection של DNA פלסמיד קידוד חלבון של עניין. תאים אז היו lysed, ריכוז החלבון מנורמל, וכמויות שווים של זיקת lysate מטוהרים על agarose אנטי-GFP. כמויות שווה של eluate אוחדו לאחר מכן והגישו לניתוח LC-MS/MS. התוצאות של ניתוח זה מעובד מכן לזהות חלבון אמון גבוה: אינטראקציות חלבון (איור 1).immunoprecipitation SILAC מאפשרת זיהוי לא רק אינטראקציות ישירות אלא גם זיקה נמוכה או אינטראקציות עקיפות עם קומפלקסי חלבונים 4. באמצעות מערכת זו, immunoprecipitations eIF4AI והשני אפשר זיהוי לשעתק ובטוח בעצמו של השותף העיקרי מחייב eIF4G (isoforms I / II ו-III) 5, כמו גם יחסי גומלין עקיפים עם eIF4E, ומספר רבים של רכיבים המורכבים eIF3.
אסטרטגית הנפתח SILAC המתוארת כאן מהווה אמצעי רגיש מאוד ורב עוצמה של גילוי חלבון חדש: אינטראקציות חלבון, ויתר על כן מאפשרת האפליה המהירה ופשוטה של דפוסים המחייבים שינו בין דגימות קשורות קשר הדוק של עניין. בדוגמא זו טכניקה זו הייתה בשימוש כדי לחקור את החלבון: אינטראקציות חלבון של חלבוני eIF4AI וeIF4AII 6. לידיעתו של המחבר, זהו המחקר הראשון בספרות מנצלת את השירות של פרוטאומיקה SILAC לחקור interactome הסלולרי של שני isoforms של eIF4A אלה.
הגישה כפי שתואר לעיל משתמשת GFP-תג ואנטי-GFP חרוזים 9, 10 ולכן שינויים עשויים להידרש כדי לאפשר גישה זו כדי לשמש לחלבון ספציפי של עניין, לדוגמא אם התג ממוקם בN-או C-סופית של חלבון. איפה, כתמים מערביים אפשריים או מבחני פונקציונליים צריכיםיש לבצע כדי לזהות מחייב של שותף אינטראקציה חלבון ידוע. צריך חלבון לא יסבול היתוך עם תג ה-GFP, תיוג אחר או אסטרטגיות הנפתח הוחלו pulldowns SILAC באמצעות שני תגים אחרים (FLAG 11, 12 ביוטין, סטרפטוקוקוס (הנתונים שלו,) לא פורסם), או על ידי שימוש בנוגדנים ראשוניים נגד חלבון עניין שבו מציאה siRNA של חלבון המטרה מספקת מדגם שליטה 13. ניסויים כאלה כבר מתוארים במקומות אחרים בספרות, אבל בקצרה, שלב 1 ושלבים 5.4-8 היינו להיות מיושמים כאמור לעיל, בצעדים 2-5.3 שונה בהתאם למערכת ביטוי / הנפתח של בחירה באמצעות תשומות חלבון שווים כפי שמתואר ב צעדים 2.4-2.5. כשלבי הכימות לאפשר חלבונים המחייבים שאינם ספציפיים שיש להסיר ברמת הניתוח, מומלץ להשמיט מראש דגירה עם חרוזים שליטה, או שטיפות מלח גבוהות על מנת לשמר חלבון דל זיקה: אינטראקציות חלבון עם חלבון של עניין . Ma nucleasey להיכלל או הושמט מפרוטוקול זה על פי הפרטים של ניסוי מסוים. לדוגמא: כמו החלבונים המשמשים בשיטה זו הם helicases RNA, קוקטייל RNase נכלל בפרוטוקול כדי להסיר אינטראקציות עקיפות בתיווך באמצעות RNA (שלב 3.2). במקרים מסוימים עם זאת, יכול להיות שיש להפיק תועלת מביצוע ניסויים במקביל עם ובלי nuclease לזהות אינטראקציות תלויות חומצות גרעין.
בתוך פרוטוקול זה, המיתוג של "בינוני" ודגימות 'כבדות' בניסויים לשכפל מומלץ לשלוט וריאציה הוצגה על ידי הבדלים בתקשורת SILAC או צמיחת תאים. שליטה חלופית כרוכה במעבר הרציף של כל שלושה (, 'הבינוני', 'אור' ו 'הכבדות') כלי התקשורת בניסויי העתק. בעוד גישה זו היא שעלולה להיות מחמירה יותר, זה להגדיל את המורכבות של הניתוח, כמו בלשכפל אחד לפחות, חלבון של עניין wחולה להיות מיוצר בתאים 'אור' שכותרתו ולכן יש צורך להבחין בין החלבונים שזוהו באופן עקבי בדגימות 'אור' (מזהמים סביבתיים כגון keratins), ואלה שמועשרים רק בדגימות 'אור' כאשר חייב חלבון של ריבית.
תוך השימוש בנתוני כימות מאפשר אפליה של ספציפיות מאינטראקציות לא ספציפיות באמצעות שימוש בסף, באופן בלתי נמנע כמה אינטראקציות אמיתיות עשויות להיות מושלכת. הגישה הנ"ל היא גישה פשוטה ומהירה לזיהוי חלבון: אינטראקציות חלבון זה יכול להיות ניסיון בקלות על ידי חוקרים ללא ניסיון קודם עם ספקטרומטריית מסה, או ניתוח של חלבון גדול: מערכי נתונים אינטראקציה חלבון. עבור רוב השימושים זה יותר ממספיק לזיהוי חלבונים חדשים של עניין. שינויים בהמשך לגישה זו כדי לעזור להפחית אובדן נתונים זה מתוארים במקומות אחרים בספרות, וכוללים שימוש ביחסי ציבורספרייה בתדירות otein בי ידועות חלבונים מזהמים לקבוצה מסוימת של פרמטרים ניסיוניים (קו תא, מטריצת חרוז, תנאי חיץ) עשויה להיות שלילית 10, 14. עם זאת, בהתאם לפרמטרים של ניסוי מסוימים זה עשוי להיות נחוץ כדי להפעיל מספר ניסויי שליטה לייצר proteome חרוז וזה ולכן יכול להגביר הן את חשבון והמורכבות של הניסוי. מידע נוסף על טכניקה זו הוא זמין מאתר האינטרנט www.peptracker.co.uk 14.
צריך גם לציין, כי הפרוטוקול שתואר לעיל כרוך בערבוב דגימות שכותרתו שונה בסופו של תהליך immunoprecipitation (שמכונה ערבוב לאחר טיהור – ניסוי SILAC MAP). הדבר נעשה כחלבון: אינטראקציות חלבון להתרחש בשיווי משקל נתון 15. יש לציין שקבוצות אחרות יש בשילוב גישת SILAC מפה זו מתוארת בפרוטוקול זה עם דגירה של הדגימותלפני הנפתח (טיהור לאחר ערבוב – PAM SILAC) עבור אורכים שונים של זמן (20 דקות לשעה 2 היו בשימוש בספרות) 15, 16. בהתבסס על כמה מהר יחס חלבון יורד לכיוון 1:1, ניתן לחקור באופן איכותי זיקות מחייבות ולהגדיר חלבונים כמו חלבוני אינטראקציה יציבים או דינמיים 15.
לסיכום, pulldowns SILAC מייצג אמצעי רב עוצמה לזיהוי חלבונים באינטראקציה עם חלבון נתונה של ריבית, בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. הטכניקה יכולה להיות מותאמת בקלות למספר אסטרטגיות טיהור שונות, המאפשרת יישום שלה לכל חלבון נתונה של ריבית. כימות של תוצאות בהרבה מפשטת זיהוי של אינטראקציות אמיתיות, ומאפשרת הרפיה של תנאי חיץ מחמירים המשמשים להסרת קלסרים שאינם ספציפיים, ובכך שומרת על אינטראקציות זיקה נמוכות. כפי שניתן לעומת עד שלוש דגימות באמור לעילאסטרטגיה, יש לו את הטכניקה עוצמות ברורות בהשוואת הבדלים בחלבון קושר בין isoforms שונה חלבון, חלבוני מוטציה, או את ההשפעה של מעכבים תרופתיים. כפרוסות ג'ל כל מנותחות ולא להקות בודדות שכתם על ידי Coomassie, המספרים של חלבונים שזוהו בוודאות גבוהה הם בדרך כלל גבוהים יותר מאלה שזוהו בGST / TAP-הנפתח סטנדרטיים, והנסיין הטיה בבחירת חלבונים של עניין מוסר. הטכניקה ולכן משווה מאוד לטובה עם טכניקות נפוצות אחרות המשמשות בזיהוי של חלבונים אינטראקציות רומן (שמרים 2 היברידי, GST / או pulldowns TAP).
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן Wellcome וBBSRC לIG. IG הוא Wellcome עמית בכיר.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |