Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET
Summary
Diese Studie stellt eine detaillierte experimentelle Verfahren zur Looping Dynamik der Doppelstrang-DNA mit Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zu messen. Das Protokoll beschreibt auch, wie die Looping-Wahrscheinlichkeitsdichte genannt J-Faktor zu extrahieren.
Abstract
Biegen der Doppelstrang-DNA (dsDNA) mit vielen wichtigen biologischen Prozessen wie der DNA-Protein-DNA-Erkennung und Verpackung in Nukleosomen verbunden. Thermodynamik der dsDNA Biege wurde durch eine Methode namens Cyclisierung, die auf DNA-Ligase kovalent zu verbinden setzt kurz klebrigen Enden eines dsDNA sucht. Allerdings kann Ligationseffizienz durch viele Faktoren, die nicht verwandt sind dsDNA Looping, wie die DNA-Struktur rund um die klebrigen Enden verbunden, und Ligase betroffen sein können auch die scheinbare Schleifenrate beeinflussen durch Mechanismen wie unspezifische Bindung. Hier zeigen wir, wie man dsDNA Looping Kinetik ohne Ligase durch Erfassen transienter DNA-Schleifenbildung durch FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) zu messen. dsDNA-Moleküle werden mit einem einfachen PCR-basiertes Protokoll mit einem FRET-Paar und einem Biotin-Linker konstruiert. Die Schleifenwahrscheinlichkeitsdichte als die J-Faktor bekannt ist, aus dem Looping Rate und der Kühlrate zwischen zwei abschaltung extrahiertted klebrigen Enden. Durch das Testen zwei dsDNAs mit verschiedenen intrinsischen Krümmungen zeigen wir, dass die J-Faktor ist sensibel für die Eigenform der dsDNA.
Introduction
Das Verständnis der mechanischen Eigenschaften von dsDNA ist von grundlegender Bedeutung in der Grundlagenwissenschaften und technische Anwendungen. Die Struktur der dsDNA ist komplizierter als eine gerade, weil spiralförmigen Leiter Rolle, Neige-und Verdrehungswinkel zwischen aufeinanderfolgenden Basenpaare mit der Sequenz variieren. Temperaturschwankungen können dazu führen, dsDNA zu unterschiedlichen Modi Konformationsfluktuationen wie Biegen, Verdrehen und Strecken unterzogen werden. Übergänge wie Schmelzen und Knicken kann auch unter extremen Bedingungen auftreten.
Unter dieser Bewegungen hat dsDNA Biege die auffälligste biologische Wirkung ein. dsDNA Biegung mit Gen-Repression oder Aktivierung, indem zwei entfernten Standorten nahe einander zugeordnet. Es spielt auch eine wichtige Rolle bei der DNA-Verpackung im Zellkern oder ein virales Kapsid. Biegeverformung dsDNA kann experimentell durch die hochauflösende Mikroskopie (AFM-und TEM-2 3) und der ThermoDyn visualisiert werdenamics und Kinetik kann durch Looping-Assays, die chemisch verbinden nebeneinander liegenden Stellen des dsDNA sucht werden.
Ein solcher Test ist Ligase-abhängig Cyclisierung 4. In diesem Assay werden dsDNA-Molekülen mit "klebrig" (kohäsiven) Enden zirkularisiert oder durch DNA-Ligase dimerisiert. Durch Vergleichen der Raten der Kreis und die Dimer-Bildung, kann man eine effektive molare Konzentration von einem Ende der DNA in der Nähe des anderen Endes, die als J-Faktor bekannt ist, erhalten. Dieser Faktor ist dimensions J entspricht der Wahrscheinlichkeitsdichte des Findens ein Ende der DNA in einem kurzen Abstand von dem anderen Ende, und spiegelt damit die Flexibilität der DNA. Die Messung der J-Faktor als Funktion der DNA-Länge zeigt viele Merkmale über die DNA Mechanik einschließlich der Persistenz Länge 4,5.
Das wurmartige Kette (WLC)-Modell wurde weithin als der kanonischen Polymer-Modell für dsDNA Mechanik basierend auf dem Erfolg in Erklärungen angesehenining der Kraft-Dehnungs-Kurven in DNA ziehen Experimente 6 und richtig Vorhersage der J Faktoren dsDNAs länger als 200 bp 7 erhalten. Allerdings mit der Cyclisierung Assay an dsDNA-Moleküle so kurz wie 100 bp, Cloutier und Widom maßen die J Faktoren, um mehrere Größenordnungen höher als die WLC-Modell-Vorhersage 8 sein. Ein Jahr später, Du et al. J Faktoren erzeugt im Einvernehmen mit dem WLC-Modell mit dem Cyclisierung Assay mit niedrigeren Konzentrationen von Ligase und schrieb den anomalen Ergebnis aus der Gruppe Widom hohen Konzentrationen verwendet Ligase 9. Diese Kontroverse zeigt beispielhaft die unvermeidlichen Einfluss der DNA-Ligase auf Cyclisierung Kinetik bei Verwendung der herkömmlichen Assay 9. Darüber hinaus kann auch auf DNA-Ligase DNA-Struktur und Steifigkeit durch unspezifische Bindung 10,11.
Um die technischen Belange der Protein-abhängige Looping-Assays zu beseitigen, vor kurzem haben wir gezeigt, eine protein-kostenlos Looping Assay, der auf Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) 12. In diesem Verfahren werden geschleift Konformationen von FRET zwischen dem Donor und Akzeptor in der Nähe der klebrigen Enden eines DNA-Moleküls gebunden nachgewiesen. Eine Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopobjektiv-Typ (TIRF) verwendet, um Bahnen der reversible Looping und unlooping Ereignisse von der Oberfläche immobilisierten DNA-Einzelmoleküle für einen längeren Zeitraum aufzuzeichnen. Diese Methode bietet PCR-basierten Aufbau von DNA-Molekülen an Mismatch-freie DNA-Moleküle, die eine entscheidende Verbesserung gegenüber einer ähnlichen Methode Vafabakhsh und Ha 13 zu generieren. Die Einzelmolekül-Aspekt dieses Protokoll ermöglicht die Messung von Verteilungen zusätzlich zu Durchschnittswerte Ensemble während der FRET-Aspekt ermöglicht es, DNA-Looping Dynamik wiederholt aus dem gleichen Molekül messen, auch unter Bedingungen, die Ligase-Aktivität beeinträchtigen können.
Die TIRFM Aufbau ist in Abbildung 1 dargestellt. Eine benutzerdefinierteGestalteten Probentisch wird über eine Olympus IX61 Mikroskop Körper platziert. 532 nm und 640 nm-Laser von der Seite eingeführt werden und durch kleine elliptische Spiegel 14 in den hohen NA Ziel reflektiert wird, um kritische Einfallswinkel, unter dem Deckglas-Wasser-Grenzfläche zu erreichen. Wir stellen fest, dass eine weit verbreitete Durch Ziel TIR mit dichroitischen Spiegeln oder Prismen TIR-basierte Setups können auch für diese FRET-Anwendung verwendet werden. Das Fluoreszenzbild durch das Mikroskop gebildet wird durch einen dichroitischen Spiegel in Donor-und Akzeptor-Bilder aufgeteilt. Sie werden dann auf beiden Hälften eines EMCCD erneut abgebildet. Weitere Langpassemissionsfilter verwendet werden, um Hintergrundsignal zu reduzieren.
Die Temperaturregelung ist unerlässlich für den Erwerb reproduzierbare kinetischen Daten. Zur Temperaturregelung wird das Ziel aus dem Mundstück des Mikroskopkörpers um die Wärmeübertragung und Wasser von einer Temperatur gesteuert Kühler / Heizung minimieren getrennt durch eine Messing-Kragen, die eng passt in Umlaufum die innere Metall unter der Ziel-Jacke. Diese Einrichtung ist in der Lage, stabile Temperaturregelung an der Deckfläche zwischen 15 und 50 ° C (Fig. 2) zu erreichen. In dieser Arbeit wurde die Probentemperatur auf 24 ° C gehalten wird
Das folgende Protokoll zeigt die Schritt-für-Schritt-Verfahren für die DNA-Konstruktion, die Einschätzung der DNA-Form, Einzelmolekül-Experiments, und J-Faktor Bestimmung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine einfache Einzelmolekül-FRET-Assay, der auf Looping wurde verwendet, um die Kinetik der DNA von verschiedenen Eigenformen zu studieren. Gekrümmt DNAs können durch Wiederholen eines 10-mer-Sequenz in Phase mit dem Schrauben Zeitraum von 10,5 bp, hergestellt werden, und deren Krümmungen mit PAGE abgeschätzt werden. Diese dsDNAs werden mit klebrigen Enden entwickelt, um transienten Schleife Stabilisierung ermöglichen. Es extrahiert den Schlingengeschwindigkeit von der exponentiellen Anstieg in der Anzahl der Mole…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken James Waters, Gable Wadsworth und Bo Broadwater für das Manuskript kritisch zu lesen. Wir danken auch vier anonymen Gutachtern für die Bereitstellung von nützlichen Kommentare. Wir danken für die finanzielle Unterstützung von Georgia Institute of Technology, der Burroughs Wellcome Fund Career Award in der Scientific-Schnittstelle, und dem Studenten-Forschungsnetzwerk Zuschuss von NSF Physik lebender Systeme.
Materials
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 mL | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2um CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2000 1g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532nm 50mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25×36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
Riferimenti
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