Summary
Denne undersøgelse viser en detaljeret eksperimentel fremgangsmåde til at måle looping dynamik dobbeltstrenget DNA under anvendelse af enkelt-molekyle Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). Protokollen beskriver også, hvordan at udtrække looping sandsynlighedsfordelingen kaldet J faktor.
Abstract
Bøjning af dobbeltstrenget DNA (dsDNA) er forbundet med mange vigtige biologiske processer såsom DNA-protein-genkendelse og DNA emballage, nukleosomer. Termodynamik dsDNA bøjning er blevet undersøgt af en metode kaldet ringslutning som beror på DNA-ligase til kovalent slutte korte klæbrige ender af et dsDNA. Dog kan ligatur effektivitet påvirkes af mange faktorer, som ikke er relateret til dsDNA looping såsom DNA-struktur omkring tiltrådte klæbrige ender, og ligase kan også påvirke den tilsyneladende looping sats gennem mekanismer såsom uspecifik binding. Her viser vi, hvordan man kan måle dsDNA looping kinetik uden ligase ved at afsløre forbigående DNA loop dannelse af FRET (fluorescensresonansenergioverførsel). dsDNA molekyler er konstrueret ved hjælp af en simpel PCR-baseret protokol med et FRET-par og en biotinlinkeren. Looping sandsynlighedsfordelingen kendt som J faktor ekstraheres fra looping sats og annealing hastighed mellem to frakoblingted klæbrige ender. Ved at teste to dsDNAs med forskellige iboende krumninger, viser vi, at J faktor er følsom over for den indre form af dsDNA.
Introduction
Forstå de mekaniske egenskaber af dsDNA er af fundamental betydning i Grundvidenskab og ingeniørmæssige anvendelser. Strukturen af dsDNA er mere kompliceret end en straight spiralformet stige fordi roll, vippe, og snoningsvinkler mellem på hinanden følgende basepar kan variere med sekvens. Termiske fluktuationer kan forårsage dsDNA til at gennemgå de forskellige former for konformationelle udsving såsom bøjning, vridning og udspænding. Overgange såsom smeltepunkt og knæk kan også forekomme under ekstreme forhold.
Blandt disse bevægelser, dsDNA bøjning har det mest bemærkelsesværdige biologiske virkning 1.. dsDNA bøjning er forbundet med genet undertrykkelse eller aktivering ved at bringe to fjerne steder tæt på hinanden. Det spiller også en vigtig rolle i DNA emballage i cellekernen eller et viralt capsid. Bøjningsdeformering af dsDNA kan visualiseres eksperimentelt ved høj opløsning mikroskopi (AFM 2 og TEM 3) og thermodynAmics og kinetik kan studeres ved looping assays, som kemisk linker sidestillede steder i dsDNA.
Et sådant assay er ligase-afhængig ringslutning 4. I dette assay er dsDNA molekyler med "klæbrige" (kohæsive) ender cirkulariseret eller dimeriseret ved DNA-ligase. Ved at sammenligne satserne for cirkel og dimerdannelse, kan man opnå en effektiv molære koncentration af den ene ende af DNA i nærheden af den anden ende, der er kendt som J faktor. Denne J faktor er dimensionsmæssigt svarer til sandsynlighedstætheden for at finde den ene ende af DNA ved en kort afstand fra den anden ende, og afspejler således fleksibiliteten af DNA'et. Måling J som funktion af DNA længde afslører mange karakteristika om DNA mekanik herunder persistens længde 4,5.
Ormen-lignende kæde (WLC) model er blevet bredt anerkendt som den kanoniske polymer model for dsDNA mekanik baseret på dens succes i forklaringlingen af kraft-udvidelse kurver opnået i DNA trække eksperimenter 6, og korrekt forudsige J faktorer dsDNAs længere end 200 bp 7. Men ved hjælp ringslutningen analyse på dsDNA molekyler så korte som 100 bp, Cloutier og Widom måles, J faktorer at være flere størrelsesordener højere end WLC model forudsigelse 8. Et år senere, Du et al. produceret J faktorer i aftale med WLC model ved hjælp cycliseringen assay med lavere koncentrationer af ligase og tilskrives den afvigende resultat fra Widom gruppe høje ligase koncentrationer brugt 9. Denne kontrovers eksemplificerer den uundgåelige påvirkning af DNA-ligase på ringslutningsprocedurer kinetik, når du bruger den konventionelle assay 9. Desuden kan DNA-ligase også påvirke DNA-struktur og stivhed ved specifik binding 10,11.
For at eliminere de tekniske bekymringer protein-afhængige looping analyser, vi for nylig vist en protein-fri looping assay baseret på Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 12.. I denne fremgangsmåde sløjfes konformationer påvises ved FRET mellem donoren og acceptoren fastgjort nær de klæbrige ender af et DNA-molekyle. En objektiv-typen total intern refleksion fluorescens mikroskop (TIRFM) bruges til at registrere baner af reversibel looping og unlooping begivenheder fra overfladeimmobiliseret enkelt DNA-molekyler i en længere periode. Denne metode har PCR-baseret samling af DNA-molekyler til at generere mismatch-fri DNA-molekyler, som er en afgørende forbedring i forhold til en lignende metode Vafabakhsh og Ha 13. Den fælles-molekyle aspekt af denne protokol tillader måling af udlodninger i tillæg til ensemble gennemsnit, mens FRET aspekt gør det muligt at måle DNA looping dynamik gentagne gange fra det samme molekyle, selv i forhold, der kan forringe ligase aktivitet.
Den TIRFM setup er vist i figur 1.. En brugerdefineretDesignede modellen stadie er placeret over et Olympus IX61 mikroskop krop. 532 nm og 640 nm lasere indføres fra siden og reflekteres af bittesmå elliptiske spejle 14 i høj NA målet at opnå en kritisk indfaldsvinkel på dækglasset-vand-grænsefladen. Vi bemærker, at mere udbredt gennem-objektiv TIR hjælp dichroic spejle eller prisme-baserede TIR opsætninger kan også bruges til denne ansøgning FRET. Fluorescens billede dannet af mikroskopet er opdelt i donor-og acceptor-billeder af et dikroisk spejl. De bliver derefter igen afbildet på to halvdele af en EMCCD. Yderligere lang pass emission filtre anvendes til at reducere baggrundssignal.
Temperaturkontrol er vigtig for at erhverve reproducerbare kinetiske data. For temperaturkontrol er målet adskilt fra næsestykket af mikroskopet kroppen til at minimere varmeoverførsel, og vand fra en temperaturstyret chiller / varmelegeme cirkuleres gennem en messing krave, stramt passeromkring den indre metal under målet jakke. Denne opsætning er i stand til at opnå en robust temperaturkontrol på dækglasset overflade mellem 15 og 50 ° C (figur 2). I dette arbejde blev prøven holdes temperaturen ved 24 ° C.
Følgende protokol viser trin-for-trin procedure til DNA-konstruktion, estimering af DNA facon, single-molekyle eksperiment, og J-faktor beslutsomhed.
Protocol
Representative Results
Discussion
En simpel enkelt molekyle assay baseret på FRET blev anvendt til at studere looping kinetik DNA'er af forskellige iboende former. Buede DNA kan fremstilles ved at gentage en 10-mer sekvens i fase med spiralformede periode på 10,5 bp og deres krumninger kan estimeres ved hjælp af PAGE. Disse dsDNAs er designet med klæbrige ender til at tillade forbigående loop stabilisering. Vi ekstraheret looping sats fra den eksponentielle stigning i antallet af løkkeformede molekyler over tid. Annealing hastighedskonstant me…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker James Waters, Gable Wadsworth og Bo Broadwater for kritisk læsning af manuskriptet. Vi takker også fire anonyme anmeldere for at give nyttige kommentarer. Vi anerkender økonomisk støtte fra Georgia Institute of Technology, Burroughs Wellcome Fund Career Award på videnskabeligt forbindelsesled, og den studerende forskningsnetværk bevilling fra NSF Fysik af Leve-Systems.
Materials
| Small DNA FRAG Extract Kit-100PR | VWR | 97060-558 | |
| Acrylamide 40% solution 500 mL | VWR | 97064-522 | |
| Bis-acrylamide 2% (w/v) solution 500 mL | VWR | 97063-948 | |
| GeneRuler 100 bp DNA Ladder, 100-1000 bp | Fermentas | SM0241 | |
| Mini Vertical PAGE System | VWR | 89032-300 | |
| Syringe filter 0.2um CS50 | VWR | A2666 | |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813-1G | triplet state quencher |
| Protocatechuic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | 08992-50MG | oxygen scavenging system |
| Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | oxygen scavenging system |
| mPEG-silane, MW 2000 1g | Laysan Bio | MPEG-SIL-2000-1g | |
| Biotin-PEG-Silane, MW 3400 | Laysan Bio | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Avidin, NeutrAvidin Biotin-binding Protein | Invitrogen | A2666 | |
| Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | F-540L | |
| Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit | IBI Scientific | IB47020 | |
| Premium plain glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| VWR micro cover glass, rectangular, no. 1 | VWR | 48404-456 | |
| Fisher Scientific Isotemp 1006s Recirculating Chiller/Heater | Fisher Scientific | temperature control | |
| Objective Cooling Collar | Bioptechs | 150303 | temperature control |
| KMI53 Biological Micrometer Measuring Stage | Semprex | KMI53 | |
| High Performance DPSS Laser 532nm 50mW | Edmund optics | NT66-968 | Cy3 excitation |
| CUBE Fiber Pigtailed 640 nm, 30mW, Fiber, FC/APC Connector | Coherent | 1139604 | Cy5 excitation |
| 650 nm BrightLine Dichroic Beamsplitter | Semrock | FF650-Di01-25×36 | splitting dichroic |
| LaserMUX Beam Combiner, reflects 514.5, 532, & 543.5 nm lasers, 25 mm | Semrock | LM01-552-25 | combining dichroic |
| Brightline Fluorescence Filter 593/40 | Semrock | FF01-593/40-25 | Cy3 emission filter |
| 635 nm EdgeBasic LWP longpass Filter, 25 mm | Semrock | BLP01-635R-25 | Cy5 emission filter |
| EMCCD iXon+ | Andor Technology | DU-897E-CS0-#BV | |
| IX51 inverted microscope frame | Olympus | ||
| Objective UApo N 100x/1.49 Oil TIRF | Olympus | ||
| Immersion oil type-F for fluorescence microscopy | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| 2mm Diameter 45° Rod Lens Aluminum Coated | Edmund optics | 54-092 | miniature mirror |
| 1/4" Travel Single-Axis Translation Stage | Thorlabs | MS-1 | translation of miniature mirror |
| Ø1" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=200 mm | Thorlabs | AC254-200-A | focusing lens |
| Adjustable Mechanical Slit | Thorlabs | VA100 | |
| Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E02 | |
| Ø1" Achromatic Doublet, f = 100 mm | Thorlabs | AC254-100-A | relay lens |
| Lens Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | LMR1 | |
| Dichroic Filter Mount | Thorlabs | FFM1 | |
| Fixed Cage Cube Platform | Thorlabs | B3C | |
| Kinematic Mount for Ø1" Optics | Thorlabs | KM100 | |
| N-BK7 Plano-Convex Lens, Ø1", f = 40 mm | Thorlabs | LA1422-A | collimating lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 15 mm | Thorlabs | LA1222-A | telescope lens |
| N-BK7 Plano-Convex Lense, Ø6.0 mm, f = 150 mm | Thorlabs | LA1433-A | telescope lens |
Riferimenti
- Garcia, H. G., et al. Biological consequences of tightly bent DNA: The other life of a macromolecular celebrity. Biopolymers. 85, 115-130 (2007).
- Wiggins, P. A., et al. High flexibility of DNA on short length scales probed by atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 1, (2006).
- Lionberger, T. A., et al. Cooperative kinking at distant sites in mechanically stressed DNA. Nucleic Acids Research. 41, 6785-6792 (2011).
- Shore, D., et al. DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 4833-4837 (1981).
- Geggier, S., Vologodskii, A. Sequence dependence of DNA bending rigidity. Proc Nat Acad Sci U S A. 107, 15421-15426 (1992).
- Smith, S. B., et al. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Peters, J. P., Maher, L. J. DNA curvature and flexibility in vitro and in vivo. Quarterly Reviews of Biophysics. 43, 23-63 (2010).
- Cloutier, T. E., Widom, J. Spontaneous sharp bending of double-stranded DNA. Molecular Cell. 14, 355-362 (2004).
- Du, Q., et al. Cyclization of short DNA fragments and bending fluctuations of the double helix. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 5397-5402 (2005).
- Yuan, C., et al. T4 DNA ligase is more than an effective trap of cyclized dsDNA. Nucl. Acids Res. 35, 5294-5302 (2007).
- Manzo, C., et al. The effect of nonspecific binding of lambda repressor on DNA looping dynamics. Biophysical Journal. 103, 1753-1761 (2012).
- Le, T. T., Kim, H. D. Measuring shape-dependent looping probability of DNA. Biophys. J. 104, 2068-2076 (2013).
- Vafabakhsh, R., Ha, T. Extreme bendability of DNA less than 100 base pairs long revealed by single-molecule cyclization. Science. 337, 1097-1101 (2012).
- Friedman, L., et al. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical Journal. 91, 1023-1031 (2006).
- Kaplan, N., et al. The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome. Nature. 458, 362-366 (2009).
- Koo, H. S., Crothers, D. M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending. Proc Nat Acad Sci U S A. 85, 1763-1767 (1988).
- Prosseda, G., et al. A temperature-induced narrow DNA curvature range sustains the maximum activity of a bacterial promoter in vitro. Biochimica. 49, 2778-2785 (2010).
- Rasnik, I., et al. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3, 891-893 (2006).
- Cordes, T., et al. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. J. Am. Chem. Soc. 131, 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., et al. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
- Taylor, W. H., Hagerman, P. J. Application of the method of phage T4 DNA ligase-catalyzed ring-closure to the study of DNA structure: II. NaCl-dependence of DNA flexibility and helical repeat. Journal of Molecular Biology. 212, 363-376 (1990).
- Bolshoy, A., et al. Curved DNA without A-A: experimental estimation of all 16 DNA wedge angles. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 2312-2316 (1991).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucl. Acids Res. 37, 6984-6990 (2009).
- Vologodskii, A., et al. Bending of short DNA helices. Artif DNA PNA XNA. 4, (2013).
- Hoover, D. M., Lubkowski, J. DNAWorks: an automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis. Nucl. Acids Res. 30, (2002).
- Waters, J. T., Kim, H. D. Equilibrium Statistics of a Surface-Pinned Semiflexible Polymer. Macromolecules. 46, 6659-6666 (2013).
- Mills, J. B., et al. Electrophoretic evidence that single-stranded regions of 1 or more nucleotides dramatically increase the flexibility of DNA. Biochimica. 33, 1797-1803 (1994).
